新β-内酰胺酶基因blaRAA-1的功能鉴定及在畜禽养殖环境中的流行分布和传播特性

The production of β-lactamase is the main mechanism of β-lactam drug resistance in pathogens, and its distribution and prevalence pose a serious threat to global health. In the previous study, we found a new β-lactamase gene in Riemerella anatipestifer (RA) and proposed to apply the name blaRAA-1. The preliminary results showed that blaRAA-1 can confer high-level β-lactam drug resistance, and only one RA isolate carries this gene. However, the origin, distribution, structure, function, and transmission of blaRAA-1 gene are unclear. In this project, the structure and function properties of RAA-1, i.e. active enzyme sites, enzyme kinetic parameters and enzyme hydrolyzed products, are going to be studied by gene cloning, expression, protein purification and mass spectrometry. Subsequently, this project intends to study the distribution and prevalence of this gene by PCR detection of metagenome DNA from environmental samples of livestock and poultry farms, and to isolate and identify strains carrying blaRAA-1 gene. Finally, the transferable genetic components of the gene were analyzed to investigate their transmission characteristics. The research results of this project can provide a scientific instruction for the rational use of antibacterial drugs in factory livestock and poultry disease prevention and treatment.

产β-内酰胺酶是病原菌β-内酰胺药物耐药的主要机制，其传播和流行严重威胁全球健康。在前期研究中，我们在鸭疫里默氏菌 (Riemerella anatipestifer, RA)中发现一新的β-内酰胺酶基因，拟申请命名blaRAA-1。预实验结果显示：blaRAA-1可介导高浓度β-内酰胺药物耐药，且仅有一株RA携带该基因。但是对于基因的来源、分布流行、结构和功能以及是否具有转移性等尚不清楚。本项目拟通过基因克隆、表达和蛋白纯化，蛋白结构及特性、酶活性位点、酶动力学参数等测定以及酶分解产物质谱分析进行RAA-1结构和功能研究。随后，拟通过对畜禽养殖场环境样本的宏基因组DNA进行PCR检测以及blaRAA-1阳性菌株的分离鉴定，以研究该基因的流行分布。最后，对该基因的可转移遗传元件分析，研究其传播特性。本项目的研究成果可为养殖业中合理使用抗菌药物以预防和治疗疾病提供一定科学依据。

产β-内酰胺酶是病原菌β-内酰胺药物耐药的主要机制，其传播和流行严重威胁全球健康。本项目针对发现的全新型超广谱β-内酰胺酶（ESBL）RAA-1，阐明其功能及在畜禽病原菌及养殖环境中的分布流行和传播机制。生物信息学分析显示，RAA-1与其他已报道的ESBLs相似性较低（≤65%），属于典型的A类ESBL，其活性位点为70位丝氨酸，具有4个保守的氨基酸基序。通过基因克隆、蛋白表达纯化、药物敏感性以及酶动力学测定，结果证实RAA-1具有分解超广谱β-内酰胺活性，介导高浓度β-内酰胺药物耐药。对畜禽来源的203株鸭疫里默氏菌、58株巴氏杆菌、52株猪链球菌、40株金黄色葡萄球菌、60株大肠杆菌以及30株沙门氏菌进行PCR检测以调查blaRAA-1基因在畜禽重要病原菌中的分布流行，结果证实该基因仅存在于鸭疫里默氏菌RCAD0122。通过畜禽养殖环境采样、PCR检测以及可培养菌分离鉴定，分离到一株多重耐药粪便稳杆菌SCVM0123为blaRAA-1基因阳性。全基因组测序分析表明，blaRAA-1分别存在于RCAD0122的基因组以及SCVM0123的质粒上。两者均具有相同的假定复合型转座子结构，该转座子由两端相同的IS982家族的插入序列以及中间的blaRAA-1基因组成。该基因可通过自然转化的方式在同源菌株中进行转移。本项目的研究成果是对β-内酰胺酶数据库的丰富，可为养殖业中合理使用抗菌药物提供一定科学依据。同时敦促我们需要重视新bla基因的监测，尤其是存在于移动元件上具有传播扩散可能的这类新bla基因，以防其在生产上引起广泛流行。