甲醇驱动大肠杆菌高效合成琥珀酸的代谢工程

The main reason of poor reductive metabolites synthesis yield is the shortage of NADH supply. After methanol metabolic module was successfully introduced into Escherichia coli, the generation of NADH increased the succinic acid yield. However, the accumulation of toxic formaldehyde and high gene expression occurring in pentose phosphate pathway lower the cell growth and atom economy. To further reduce formaldehyde accumulation and enhance methanol utilization efficiency, the relationship of methanol oxidation and formaldehyde assimilation will be firstly investigated, and then protein scaffolding strategy will be adopted to build a synthetic multi-enzymes complex. The regeneration of ribulose-5-phosphate will be optimized by modularity regulation of the oxidation phase and non-oxidation phase in pentose phosphate pathway. Finally, a strategy of the succinic acid production with high yield driven by methanol will be established. Implementation of this project will provide a reference for anaerobic highly efficient production of reductive metabolites from methanol.

还原力供给不足是厌氧条件下还原性代谢产物合成收率低的主要原因。申请人发现在产琥珀酸大肠杆菌中引入甲醇代谢模块可以提高胞内还原力供给水平，但中间产物甲醛的积累以及葡萄糖代谢通路的改变导致细胞生长受阻、碳原子经济性降低。本项目拟通过分析甲醇氧化与甲醛同化的相互作用关系，利用酶的支架技术构建多酶复合体并优化，减少甲醛的积累，提高工程菌株的生长性能和甲醇利用效率；通过解析相关基因与甲醇代谢的作用规律，利用启动子工程策略改变磷酸戊糖途径氧化阶段和非氧化阶段关键基因的表达强度，优化核酮糖-5-磷酸再生系统，调控碳流在大肠杆菌细胞内的流向，最终构建基于甲醇驱动的琥珀酸高效合成的重组大肠杆菌并建立其代谢调控策略。本项目的实施为利用甲醇驱动其他还原性代谢产物的高效合成提供了参考与借鉴。

本项目在产琥珀酸大肠杆菌中引入了甲醇代谢模块，通过组装不同来源和不同组合方式的甲醇氧化元件和甲醛同化元件，考察了元件与元件之间、元件与底盘之间的适配关系，结合关键酶活性检测和厌氧发酵验证，确定了来源于B. methanolicus MGA3的Mdh2和Hps-Phi操纵子为最优的甲醇代谢元件；通过优化甲醇的添加浓度，分析了不同浓度甲醇对菌株生长及产物合成的影响，结合发酵过程优化，确定了最佳的发酵调控策略，最终在添加200 mM甲醇时，分批补料条件下，琥珀酸的产量从60.82 g/L增加到68.54 g/L，收率从0.91 g/g增加到 0.99 g/g。开展了基于13C同位素标记的碳代谢流分析，LC-MS结果显示胞内多种代谢物均含有同位素标记，产物琥珀酸中有1.45%的碳被标记，MS/MS进一步证明琥珀酸羧基上的碳原子被标记；基于胞内辅酶NADH/NAD+变化分析发现重组菌株的NADH含量和NADH/NAD+均有显著下降，推测甲醇代谢产生的 NADH驱动了琥珀酸的合成，进而提高了琥珀酸的产量和收率。为进一步提高甲醇的利用能力，降低甲醛积累，过量表达了关键酶Rpe和Tkt，以强化核酮糖-5-磷酸再生，增加甲醛的同化代谢。结果显示，重组菌株的生长速率比原始菌株提高了7.1%，甲醇的消耗量增加了2.24 mM；此外，琥珀酸的产量和收率分别比 对照提高了3.9%和3.4%。本项目提出了甲醇作为还原力供体提高还原性产物合成的策略，揭示了甲醇在细胞内的碳代谢流分布规律，实现了甲醇驱动琥珀酸的生物合成，为其他还原性代谢产物的高效合成提供了参考和借鉴。