人羊水来源干细胞骨向分化研究及其在牙槽骨缺损修复中的应用

Human amniotic fluid-derived stem cell (hAFSC), one new-type of stem cells, has been proved to be capable of osteogenic differentiation. hAFSC combined with tissue engineering could be used to provide a new therapeutic approach for dental aloveolar deformity and defects. Currently, the basic and applied research on hAFSC are still in its infancy.In our previous study, it was demonstrated that hAFSC showed stronger osteogenic capability than human bone marrow stromal cell (hBMSC) did. Both BMP-2 and BMP-7 could effectively promote osteogenic differentiation of hAFSC. In order to further compare the osteogenic potential of hAFSC and hBMSC, promote osteogenic differentiation of hAFSC and evaluate the effects of hAFSC in reconstruction of dental alveolar bone defects, we intend to further study the biological characteristics, key osteogenic genes and miRNA expression differences of hAFSC and hBMSC in osteogenic differentiation. We also plan to utilize multi-level analysis to study the effects and mechanism of human BMP-2/BMP-7 gene co-transfection on osteogenic differentiation of hAFSC. Finally we study the performance of hAFSC in nude mice ectopic bone formation and reconstruction of dental alveolar bone defects in SD rat model. In summary, this project is of feasable, advanced and promising nature in exploring new theories and approaches for alveolar bone defects reconstruction.

人羊水来源干细胞（hAFSC）作为一种新型干细胞，已被证明具有明确的骨向分化潜能，应用hAFSC和组织工程技术有望为牙槽骨畸形和缺损的修复重建提供新的治疗途径。目前，hAFSC的基础和应用研究尚处于起步阶段。我们的先期研究发现hAFSC较人骨髓基质干细胞（hBMSC）表现出更强的成骨能力，且添加BMP-2和BMP-7均可有效促进其骨向分化。为了进一步比较hAFSC与hBMSC的成骨能力差异，探索促进hAFSC骨向分化的有效途径，并评价hAFSC修复牙槽骨缺损的应用效果，本课题拟深入研究hAFSC与hBMSC成骨过程中的细胞生物学特征、成骨关键基因和miRNA表达的差异，并从多水平分析BMP-2/BMP-7基因共转染对hAFSC骨向分化的作用及其机制，继而将其应用于裸鼠异位成骨和大鼠牙槽骨缺损修复研究。总之，本课题兼具可行性与先进性，研究结果有望为牙槽骨缺损修复的提供新的理论依据和治疗途径。

一、项目背景：羊水细胞除了用于产前诊断之外，还可成为极具前景的干细胞源。迄今为止，人羊水来源干细胞（hAFSCs）与骨髓间充质干细胞（hBMSCs）的成骨能力差异及其机制尚不明确，hAFSCs在牙槽骨缺损重建的应用研究尚存在较大空白。.二、主要研究内容：1 hAFSCs、hBMSCs的分离、培养、表型分析及多向分化潜能鉴定；2 hAFSCs和hBMSCs体外骨向诱导分化对比研究；3 hAFSCs和hBMSCs体内骨向分化对比研究；4 hAFSCs和hBMSCs差异表达基因Foxc2在成骨分化过程中的作用研究；5 hAFSCs修复大鼠牙槽骨临界缺损试验。.三、重要结果：1 hAFSCs较hBMSCs具有不同的细胞生物学特性，在成骨诱导后具有不同的基因表达谱特征；2 hAFSCs及hBMSCs均能促进b-TCP材料在裸鼠皮下的局部组织矿化；3 叉状核蛋白Foxc2在未分化hAFSCs和hBMSCs中存在差异表达；4 成功制备大鼠上颌牙槽骨极限缺损模型，利用hAFSCs结合富血小板血浆可以促进大鼠牙槽骨局部骨组织再生。.四、关键数据： hAFSCs及hBMSCs均能参与体内外成骨分化过程，并促进裸鼠皮下成骨特异性蛋白OCN和OPN表达；hAFSCs较hBMSCs体外骨向分化过程中碱性磷酸酶水平及矿化水平为高，在成骨诱导后较hBMSCs差异化表达成骨相关基因28种，其中Foxc1和Foxc2在hAFSCs成骨分化中的上调引起我们的注意；未分化hAFSCs低表达Foxc2而hBMSCs则表达较高水平Foxc2，成骨诱导液和BMP-2均可显著上调hAFSCs细胞中Foxc2的mRNA和蛋白质水平，且Foxc2表达的上调与BMP-2呈剂量依赖性关系；过表达Foxc2可显著抑制小鼠前成骨细胞MC3T3-E1和小鼠胚胎干细胞C3H10T1/2的细胞增殖活性，促进细胞内成骨分化关键转录因子Runx2和碱性磷酸酶的表达，抑制C3H10T1/2细胞体外脂向分化及成脂分化关键转录因子Ppar-γ的表达；利用hAFSCs结合富血小板血浆同期修复大鼠牙槽骨极限缺损可以显著提高局部骨组织再生。.五、科学意义：采用体外细胞实验与动物体内实验相结合的方法发现了hAFSCs与hBMSCs的成骨分化差异并针对其中的关键差异表达基因Foxc2开展了初步机制研究，提示hAFSCs可为牙槽骨缺损重建提供新途径。