核磁共振研究蓝光诱导的LOV2-Rit(PB)与膜相互作用的机制

Optogenetics is a biological technique that controls cell activities by the use of light. It has become a novel tool for the investigation of membrane proteins. The C-terminal polybasic domain of peripheral membrane protein Rit1 (Rit(PB)), which binds to the plasma membrane reversibly to achieves spatiotemporal control of Rit1 function as a small GTPase. However, lack of precise interaction regulation methods limited the mechanism study of Rit(PB) membrane binding. Using light to control the interaction between Rit(PB) and membrane will help us study the membrane binding mechanism. In this proposal, we aim to construct LOV2-Rit(PB), which binds to plasma membrane upon blue light excitation. Using high resolution NMR spectroscopy, we will study the mechanism that how LOV2 regulates the membrane binding function of Rit(PB).Then we will screen the membrane mimetic system as well as the lipid composition that can interact with Rit(PB) based on LOV2-Rit(PB) system, and try to elucidate the lipid recognition and interaction mechanism of Rit(PB) with membrane.

光遗传学是通过光调控生命活动的生物技术，近年来已经成为膜蛋白研究的新工具。本项目的研究对象Rit(PB)是外周膜蛋白Rit1的C端Polybasic domain。Rit(PB)通过与质膜的可逆结合使得Rit1蛋白在相应的时间和空间中发挥小GTP酶的功能。由于Rit(PB)与膜相互作用在体外很难被精准调控，膜结合的研究还相对匮乏。而利用光来调控Rit(PB)与膜相互作用，有助于我们对膜结合的机制进行深入理解。在本项目中，我们拟利用一种新型光遗传学工具LOV2，构建光控的LOV2-Rit(PB)与生物膜相互作用的体系。利用核磁共振手段，研究蓝光通过LOV2对Rit(PB)功能进行调控的机制。再以LOV2-Rit(PB)体系为基础筛选与Rit(PB)相互作用的膜体系和磷脂组成，探索Rit(PB)的磷脂识别和与膜相互作用的机制。

LOV2-Rit(PB)是由光受体LOV2和能与PI磷脂结合的polybasic（PB）结构域融合构建的一个光遗传学工具。在蓝光激发时，它能够选择性并可逆地与质膜发生相互作用，而在黑暗中，它能够释放并回到胞质中。然而LOV2-Rit(PB)的光控机制和膜结合机制尚未研究清楚。在本项目中，我们利用液体核磁共振、liposome pulldown法，SPR法等技术，发现LOV2-Rit(PB)能与含有磷酸化的PI磷脂的体外膜体系发生相互作用，特别是质膜上富含的一种酸性磷脂PI(4,5)P2。在黑暗中，LOV2通过空间位阻干扰膜结合，而光照可以将活性释放。核磁滴定和单位点突变的结果表明，正电氨基酸和疏水氨基酸对于其膜结合都是必须的，表明其膜结合是一种特异性的机制。