膜蛋白PB1F2与nanodisc膜体系相互作用的液体核磁共振研究

PB1F2 is a membrane protein encoded by influenza virus, and it is believed to be an important determinant of influenza virus virulence. Although PB1F2 is not necessary for virus replication, it localizes to the mitochondrial of immune cells and induces cell apoptosis by its interaction with mitochondrial membrane，and this further results in the deficiency of immune system. PB1F2 is an typical membrane protein, however the research about its structure related to function is limited. This proposal focus on the process and mode of interaction between PB1F2 and membrane by solution NMR and nanodiscs, in order to defining the key sequence of interaction and explaining the principle underling it. The progress will help resolving membrane associated structure of PB1F2 in order to better understand its mechanism underlying apoptotic induction.

PB1F2是A型流感病毒基因编码的膜蛋白，是流感病毒的重要致死性毒性因子。PB1F2不是流感病毒复制所必须的蛋白，但在宿主体内靶向免疫细胞线粒体膜，与线粒体膜发生相互作用并诱导细胞凋亡，从而导致宿主免疫力的降低。PB1F2是典型的膜蛋白，对其功能相关的结构生物学认识迄今为止十分有限。本申请将采用液体核磁共振的PRE、磷谱等研究手段，利用磷脂双分子纳米盘（nanodisc）作为模拟膜体系，开展PB1F2与线粒体膜相互作用的过程以及作用方式的研究，旨在明确PB1F2与线粒体相互作用的关键区域，并解释二者相互作用的分子机制，为进一步解析PB1F2的膜结合结构以及理解PB1F2诱导免疫细胞凋亡的生化过程提供研究基础。

PB1F2是由流感病毒基因编码表达的作用于宿主线粒体的膜蛋白，通过诱导免疫细胞凋亡以增强流感病毒的致病性和致命性。研究表明PB1F2主要通过线粒体外膜的TOM40进入线粒体内外膜间隙，并作用于线粒体内膜，破坏膜通透性进而诱导细胞凋亡，而我们对PB1F2与线粒体内膜相互作用的分子机制却知之甚少。本研究结合液体核磁共振以及nanodiscs模拟膜体系对PB1F2与线粒体膜的相互作用展开研究。主要取得了以下关键结果：1、针对现有nanodiscs膜体系分子量较大、不适用于液体核磁共振研究的问题针对性改造优化了MSP蛋白及nanodiscs，获得了分子量较小的稳定的nanodiscs体系。利用动态光散射、分子筛、透射电镜等方法对nanodsics进行了表征，并成功将STIM1膜蛋白组装到小的nanodiscs中。2、通过液体核磁共振结合生化方法，明确了PB1F2蛋白与模拟线粒体膜相互作用的磷脂选择性，PB1F2蛋白对磷脂的破坏作用发生于两性离子磷脂膜，对于负电荷磷脂膜没有破坏作用。3、PB1F2对模拟线粒体膜的破坏作用是时间依赖方式的，二者相互作用后产生新的protein-lipid micelle聚集体。4、PB1F2与nanodiscs膜体系的相互作用通过bicelle和liposome体系均可验证，具有同样的磷脂选择性。5、PB1F2突变体蛋白N66S与模拟膜体系的相互作用动力学过程与野生型PB1F2相似，没有显著区别。6、PB1F2的线粒体定位序列MST与模拟膜体系bicelle的相互作用与全长PB1F2不同，MTS不能对bicelle产生破坏作用。.上述结果基本揭示了PB1F2与线粒体膜的特异性相互作用，主要通过对线粒体膜含量最高的两种两亲性磷脂膜组分进行破坏作用，进而发挥其生物学功能。