Beclin1 介导的线粒体自噬在纳米氧化铝诱导的神经细胞损伤中的作用及其机制研究

It is reported that nano-materials can induce autophagy, however, the mechanism of which is unclear until now. Our research work showed that mitophagy was involved in the neural cell injury induced by nano-alumina. In the present study, we will further investigate the effect and mechanism of beclin1 mediated mitophagy in neural cell injury induced by nano-alumina. In the in-vitro experiment, we will observe the phenomena of mitophagy induced by nano-alumina at various particle-size, dosage and time point. Next, we will approach the mechanism of mitophagy, including beclin1 induce mitophagy through specific mitochondrion pathway and the dependence of beclin1 gene in the procession. Finally, in-vivo experiment will be performed to evidence the results of in vitro study. The neurotoxic effect will be observed. Beclin1 may regulate death-related proteins by altering reactive oxygen species and inflammatory factors in cortex cells, and affect learning and memory ability, which will be confirmed by the specific inhibition of Beclin1 with Spautin-1.The research work of present study will supply theoretical basis for the safety assessment of nano-materials.

现有研究表明，纳米材料能够诱导细胞自噬，但机制不清。我们的前期研究结果表明,线粒体自噬作为主要的机制参与了纳米氧化铝诱导的神经毒性作用。本项目拟进一步探讨Beclin1介导的线粒体自噬在纳米氧化铝诱导的神经细胞损伤中的作用及其机制。在原代培养神经细胞实验中观察不同粒径、剂量及时点纳米氧化铝诱导的线粒体自噬现象，应用RNA干扰手段调控纳米氧化铝诱导的线粒体自噬，探讨Beclin1特异性地通过线粒体诱导自噬和线粒体自噬对Beclin1的依赖性。体内实验中观察线粒体自噬的致神经细胞损伤作用，通过Beclin1特异性抑制剂Spautin-1的干预，验证Beclin1可能通过改变大脑皮质活性氧和炎性因子水平而调节细胞死亡相关蛋白表达，从而影响小鼠的学习记忆能力。本项目可以为纳米材料的安全性研究提供理论基础。

[目的] 探讨Beclin1介导的线粒体自噬在纳米氧化铝诱导的神经细胞损伤中的作用及其机制。[方法] 体内实验：用不同剂量纳米氧化铝（粒径<50nm）连续染毒一月后，处死小鼠，电镜观察海马CA3区神经细胞的超微结构，并测量线粒体直径；测定脑皮质Na+K+-ATPase与Ca2+Mg2+-ATPase活力，以免疫印记法检测COX-Ⅳ，Beclin1和LC3蛋白的表达量。体外实验：原代培养神经元，纳米氧化铝染毒浓度为0.5 mmol·L-1，用乳酸脱氢酶活力（LDH）测定试剂盒检测LDH活性；采用流式检测线粒体膜电位（MMP）的变化情况；透射电镜观测线粒体的超微结构和线粒体自噬的情况；单丹酰戊二胺(MDC)荧光染色观察自噬小体的形成；Western blot检测自噬有关蛋白Beclin1,LC3Ⅱ/Ⅰ的表达；Lysotracker和Mitotracker荧光共染色观察溶酶体与线粒体的重叠情况，从而探讨Beclin1特异性地通过线粒体诱导自噬和线粒体自噬对Beclin1的依赖性。[结果] 体内实验：同对照组及低剂量组相比，中剂量组的线粒体直径明显增大，但高剂量组直径显著低于中剂量组（P<0.05）；线粒体酶活力随着染毒剂量的增加而降低，与对照组相比，中、高剂量组的Na+K+-ATPase与Ca2+Mg2+-ATPase活力显著降低（P<0.05）；与低剂量组相比，中，高剂量组活力显著降低（P<0.05）；与对照、低、中剂量暴露组相比，高剂量组COX-Ⅳ蛋白表达量为显著降低（P<0.05），Beclin1表达量显著上升（P<0.05），LC3Ⅱ/LC3Ⅰ显著上升（P<0.05）。体外实验：原代培养神经元，纳米氧化铝染毒后上清液中LDH活性与对照组相比均明显增加（P<0.05），但随着时间的延长LDH活性呈下降趋势；随着染毒时间的延长，线粒体膜电位逐渐降低，且均具有统计学意义（P<0.01）；超微结构显示，染毒组观察到线粒体肿胀，空泡的形成，并且可检测到线粒体自噬体。纳米氧化铝染毒组有明显的MDC阳性细胞，且随着时间的延长阳性细胞增加；加自噬抑制剂Spautin-1后，阳性细胞减少；Beclin1和LC3Ⅱ/Ⅰ的表达随着染毒时间的延长逐渐增加。荧光共染色显示线粒体与溶酶体重合。 结论 纳米氧化铝可引起神经元细胞发生自噬以及线粒体损伤，受损的线粒体可能通过线粒体自噬作用清除。