基于模式生物斑马鱼模型的中药代谢研究新方法的建立

本研究针对中药研究的关键环节- - 体内代谢，根据申请者相关研究基础及国内外最新成果，首次提出基于模式生物斑马鱼模型的中药代谢研究新方法，以期弥补现有中药代谢研究方法的不足。本课题先期以吸收机理、代谢产物、代谢途径及代谢规律研究明确的丹参二萜醌类单体化合物丹参酮IIA、隐丹参酮为模式化合物，通过分析它们经斑马鱼作用后的动态质变与量变规律，并进一步探讨斑马鱼与哺乳动物代谢相关性，以明晰模式生物斑马鱼研究中药成分代谢的合理性。在此基础上，进一步将斑马鱼代谢模型用于研究含有丹参酮IIA和隐丹参酮的丹参多成分（丹参酮IIA、隐丹参酮等单体化合物的组合物及丹参总酮）的代谢研究，探索斑马鱼模型研究中药复杂体系代谢的合理性。模式生物斑马鱼代谢模型从中药作用的整体观出发，为中药代谢研究提供了一种简单的、模式的、生物的、系统的、高效的新思路与方法，对提高我国中药体内过程研究水平，推动中药现代化具有重要意义。

首次以斑马鱼为模型动物创新性地建立中药代谢新方法为：取斑马鱼成鱼分别置于含有20-30mL溶液的玻璃瓶中（1条鱼/瓶，23±1℃水浴），随机分组，每组5条鱼。其中1组为0.4%~1.0%DMSO纯净水（空白鱼组），另一组为中药成分、组分或提取物的0.4%~1.0%DMSO纯净水溶液（药物鱼组）。同时设空白溶剂组（0.4%~1.0%DMSO纯净水）和空白药物组（中药成分、组分或提取物的0.4%~1.0% DMSO纯净水溶液）。则鱼会通过皮肤和腔道自主连续的从溶液中吸收药物，药物的代谢物也会随着斑马鱼的排泄物被连续的排到水中，在0~24h或48h内定时取药液或鱼体，通过用高效液相色谱-质谱联用技术分析鱼体外药液和鱼体内的代谢产物，可全面掌握代谢信息，实验方法简单、可行。将该方法成功用于丹参中二萜醌类单体、单体组合物及总丹参酮的代谢，发现丹参二萜醌类化合物的脱氢与羟基化的I相代谢反应，这与现有代谢结论（大鼠、肝微粒体、细胞色素P450）的代谢机制一致，提示斑马鱼与现有代谢模型具有良好的相关性。与经典的在体代谢方法相比，斑马鱼最大限度地保留哺乳动物代谢的系统性，克服动物实验成本高、劳动强度大等缺陷，同时大大降低化合物的用量（约为大鼠用量的1/20~1/30），使量微成分（几mg）的在体代谢研究成为可能；与体外代谢方法相比，斑马鱼能有效模拟在体的完整代谢体系，实验条件简单，克服了体外实验条件苛刻，成本高，作用环节单一的缺陷。.通过深入拓展研究，我们发现斑马鱼不仅可用于药物I相代谢，还可用于药物II相代谢以及肠菌代谢研究，且能体现多代谢途径的综合结果：斑马鱼能使5-羟基黄酮、7-羟基黄酮及白杨素发生硫酸化和葡萄糖醛酸化的II相代谢；能使淫羊藿苷、宝藿苷I、朝藿定A和C发生脱葡萄糖残基的肠菌代谢；能使三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和川续断皂苷VI发生羟基化I相代谢及脱糖基肠菌代谢，且上述代谢产物与现有人或大鼠或体外代谢产物具一致性。.综上，斑马鱼代谢模型能体现在体I相、II相、肠菌及多种代谢途径的综合结果，适用于中药单体、组合物及提取物复杂体系的在体代谢研究。有利于代谢产物大量积累与分离纯化。该模型具简单、高效、低成本、化合物用量少，有望实现早期、快速预测大量量微成分的在体代谢，是一种的模式的、快速预测大量量微成分的在体代谢，是一种的模式的、生物的全新在体代谢模型。