新型碳酸氢盐缓冲腹透液上调AQP1基因表达保护腹膜功能的机制研究

Peritoneal dialysis (PD) is a major renal replacement therapy for children with end stage renal disease. Biocompatibility of peritoneal dialysis fluids (PDF) is of great importance for long-term peritonem integrity and function. New biocompatible PDF are buffered with lactate and/or bicarbonate. Few studies focus on specific effect of buffer types on biocompatibility. In previous study, we found that compared to pH neutral (pH 7.0) lactate-buffered PDF, the new pure bicarbonate-buffered PDF (pH 7.4) increase net ultrafiltration of patients on chronic PD, enhance peritoneal mesothelial cells migration and wound healing capacity by upregulating AQP1 expression, and increase peritoneal AQP1 expression of acute PD rat model with increased sodium sieving as well. Therefore, in this study, we plan to further study the impact of new bicarbonate-buffered PDF on long-term peritoneal membrane integrity and function by establishing chronic PD rat model, and the role of increased AQP1 expression of peritomeum, as well as the molecular mechanism of transcriptional regulation of AQP1 expression of peritoneal mesothelial cells by bicarbonate-buffered PDF. Performing this study is benifical to creating more biocompatible PDF with respect to better buffer types, thus can preserve long-term peritoneum function and extend life of PD patients.

腹膜透析是终末期肾病儿童重要的肾替代疗法，腹透液生物相容性对维持腹膜完整的生物活性至关重要。新型腹透液分为乳酸盐（LPDF）和/或碳酸氢盐（BPDF）缓冲体系，关注缓冲体系的研究较少。本课题前期发现，pH7.4的BPDF较pH7.0的LPDF，能增加临床患者的腹膜超滤；能上调腹膜间皮细胞AQP1表达而增加细胞的迁移和损伤修复能力；能上调大鼠急性腹透模型腹膜AQP1表达，增加腹膜的钠筛效应。本课题拟在前期工作基础上，进一步构建大鼠慢性腹透模型，观察BPDF对腹膜的长期保护作用，及AQP1在其中可能发挥的重要角色；并深入研究BPDF转录水平上调腹膜间皮细胞AQP1表达的分子机制，明确参与调控表达的特异性转录因子和关键结合的启动子序列，鉴定特异性转录因子的功能，为腹透液的缓冲体系向更好的生物相容性发展提供理论依据和新的研发策略，有助于实现更加长久安全有效的腹膜透析治疗，从而延长腹透患者的生命。

腹膜透析是尿毒症儿童重要的肾替代疗法，腹透液生物相容性对维持腹膜完整的生物活性至关重要。课题前期发现，新型碳酸氢盐缓冲腹透液能增加腹透患者的超滤，上调腹膜间皮细胞AQP1表达而增加细胞的迁移和损伤修复能力。本课题进一步确认了大鼠腹膜AQP1的表达，发现碳酸氢盐腹透液能增加大鼠腹膜的钠筛效应，与AQP1表达密切相关。本课题在293T细胞中重复了pH值对AQP1 mRNA水平表达对调节作用，构建了一系列含有AQP1潜在启动子不同区域的荧光素酶报告基因载体，鉴定了AQP1上游启动子区域，发现-2300bp至-2200bp为pH值调控AQP1表达的关键区域，且-1000bp至0处是AQP1启动转录所必须的。通过JASPAR数据库预测了AQP1上游关键区域-2200至-2300bp范围内可能结合的11个转录因子，进一步通过siRNA转染技术，发现8个基因在siRNA干扰后表达显著下降。把这8个基因的siRNAs与-2.3k区域的荧光素酶报告基因载体一同瞬时转染至293T细胞中，检测荧光素酶活性的变化显示，siRNA下调SP1、SPIB和THAP1的表达后，-2.3k区域的荧光素酶活性下调，且不受pH值调控的影响。根据预测，AQP1启动子区域第-2257至-2251的位置有一个SPIB的结合位点。通过对相应结合位点的突变研究发现，pH值的上调能够上调野生型AQP1-2.3k报告载体(WT)的荧光素酶活性，而对突变型AQP1-2.3k报告载体(MT)的荧光素酶活性无明显影响，提示pH值能够激活AQP1启动子区域第-2257至-2251位点的活性。同时，干扰SPIB的表达，pH值上调细胞AQP1的表达作用消失。上述实验说明，SPIB基因可能为潜在的影响pH调节AQP1表达的转录因子。本课题的研究结果发现了AQP1表达水平对腹膜功能的重要影响以及不同缓冲体系腹透液对AQP1表达的调节作用，确定了碳酸氢盐缓冲体系中pH值调控细胞AQP1基因表达的关键启动子序列及与其结合的特异性转录因子，明确pH值对AQP1基因表达的调控机制，有利于阐述新型碳酸氢盐腹透液保护腹膜功能的分子机制，为腹透液向更好的生物相容性发展提供新的策略，有助于实现更加长久安全有效的腹膜透析治疗。