PKCI及PKC在鸭肠炎病毒增殖中的作用研究

Duck enteritis virus (DEV) is one of the major pathogens which danger to duck industry. At present, the studies for DEV is more concentrated on its genome and proteome, while seldom related to the receptor of viral protein. RNA interference (RNAi) is a technology developing in nearly 10 years and applied widely on the study of gene function, treatment of neoplastic diseases, defense of virus infection and other fields. In our preliminary studies, Protein kinase C inhibitor (PKCI) is confirmed as the receptor of DEV nucleocapsid protein (NP28) in the host cell by the yeast two-hybrid system. The objective of this study, following our previous studies, is to confirm the role of PKCI and PKC on the proliferation of DEV by methods of real-time PCR, Western blot, electron microscopy and immunohistochemical staining, after the PKCI gene, PKC gene and NP gene was silenced respectively by RNA interference. These studies may lay the foundation for elucidation of pathogenic mechanisms and development of therapeutic drug.

鸭肠炎病毒(DEV)是危害养鸭业的重要病原之一，但对该病毒的研究多集中在病毒基因组和蛋白质组上，极少涉及到病毒蛋白受体。RNA干扰技术是近10年发展起来的一门技术，已广泛应用到基因功能研究、抗病毒感染和肿瘤疾病治疗等多个领域。项目申请人在前期工作中，通过酵母双杂交系统筛选得到了DEV核衣壳蛋白(NP28)的宿主细胞受体即蛋白激酶C抑制蛋白(PKCI)。本项目拟在此基础上，应用RNA干扰技术分别对宿主细胞PKCI及PKC基因和病毒NP28基因进行沉默后，采用实时荧光定量PCR、电子显微镜、Western blot和免疫染色法等手段，研究分析PKCI及PKC基因表达与DEV增殖的相关性，明确PKCI及PKC在DEV增殖中的作用，以期为DEV致病机理的阐明和抗病毒药物的开发奠定基础。

鸭肠炎病毒(DEV)为α-疱疹病毒，主要引起鸭、鹅和其它雁形目禽类发生一种急性、热性、败血性传染病。NP是DEV核衣壳蛋白， PKCI是DEV NP在宿主细胞上的受体。目前尚未见到有关PKCI及PKC对DEV增殖作用影响的文献报道。为此，本项目开展了以下研究工作：(1)根据GenBank相关序列信息设计特异性引物，成功建立了针对鸭PKCI、PKC以及DEV-NP基因的实时荧光定量PCR检测方法，特异性强，检测灵敏度均可达1.0×101 copies/µL。(2)采用荧光定量PCR检测显示，DEV感染0~72h时宿主细胞PKCI基因转录水平从4.19×105 copies/µL下降至1.23×105 copies/µL，而PKC基因从5.45×105 copies/µL上升到8.11×106 copies/µL，但采用RNA干扰PKCI基因还是PKC基因，DEV增殖都受到一定的抑制，说明PKCI和PKC能影响DEV的增殖过程。(3)采用PKC抑制剂SP和激活剂PMA预先处理DEF细胞再接种DEV，结果发现在DEV感染36h时，SP处理组、PMA处理组和DEV对照组的DEV-NP基因含量相应为6.65×102copies/µL、8.62×104copies/µL和2.74×104copies/µL，但随着时间的延长，SP对DEV增殖的抑制作用和PMA对DEV增殖的促进作用均很快减弱。(4)成功构建了携带pcDNA3.1-DEV-NP28/gB的重组减毒沙门氏菌，该重组细菌免疫鸭后能诱导鸭群产生良好的粘膜免疫、体液免疫和细胞免疫应答反应。(5)通过检测分析了DEV感染后鸭体组织TLR2、TLR3和TLR7基因表达变化以及鸭血液和脾脏IL-2、IL-6、IL-8、IFN-β和IFN-γ分泌情况，明确了DEV感染后鸭机体主要相关TLR分泌变化规律。(6)利用高通量RNA-seq和生物信息学技术开展了DEV感染鸭脾脏转录组研究，发现DEV感染66h、90h和114h时鸭脾脏差异表达基因相应有511、485和531个，参与免疫相关生物学过程的基因分别为70个、64个、66个，主要涉及细胞粘附、ECM受体互作等生物过程。以上研究成果为阐明DEV分子致病机理和免疫应答机制提供了重要信息。