球虫卵囊壁蛋白的鉴定与形成机制的研究

Avian coccidiosis is a disease of major economic importance to the poultry industry, which is caused by protozoan parasites of the genus Eimeria, and E. necatrix is the main pathogens of intestinal coccidiosis. Coccidian oocyst stages are highly resistant to environmental stress and chemical disinfection, and this is attributed to a durable oocyst wall. The oocyst wall is vital for the successful transmission of these parasites. The wall is bilayered and is formed by the sequential release of the contents wall forming bodies - found in the macrogametocyte stage of Coccidia. The oocyst wall is over 90% protein but few of these proteins have been studied. So the results of isolation and identification of oocyst wall protein and their precursor proteins may provide important clues for the prevention and treatment of coccidiosis. In this project the proteins extracted from oocyst wall and wall forming body of E. necatrix are analysed by two dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry respectively, and to find their precursor proteins of the oocyst wall proteins. Furthermore, the genes of target proteins are cloned by RT-PCR and RACE, and expressed in vitro. Finaly, the genes are confirmed with confocal laser scanning. Our results will help to understand the mechanism of oocyst wall proteins formation, which may provided important rationales for finding candidate molecules to kill oocyst for the prevention of coccidiosis.

鸡球虫病是由艾美耳球虫引起的一种严重危害养鸡业的寄生虫病，毒害艾美耳球虫是引起鸡小肠球虫病的主要病原。卵囊是球虫类寄生虫在宿主间传播的一个发育阶段，由受精的大配子发育而成，其囊壁是由位于球虫大配子体中的成壁体内容物相续释放形成。卵囊壁主要由蛋白质组成，由位于成壁体中的前体蛋白形成，但仅有极少数蛋白被鉴定和研究。卵囊壁对球虫类寄生虫的生存与传播十分重要，故对卵囊壁蛋白及其前体蛋白的深入研究是寻找防治球虫病的一个重要切入点。为此，本研究以鸡的毒害艾美耳球虫为研究对象，首先应用双向凝胶电泳—质谱技术分离与鉴定卵囊壁蛋白与成壁体蛋白；随后，应用生物信息学方法比较两者的蛋白质组成与功能，寻找卵囊壁蛋白的前体蛋白；接着应用RT-PCR和RACE技术克隆相关基因，体外重组表达，制备多抗，应用激光共聚焦等技术予以验证；最后解析卵囊壁蛋白形成的分子基础与机制，为寻找杀灭或抑制卵囊形成的分子靶点奠定基础。

卵囊壁是球虫类寄生虫抵抗外界不良环境、长期存活的一个重要保护屏障。而卵囊壁主要由配子体内的成壁体发育而成，解析成壁体参与卵囊壁形成的分子机制将有利于寻找杀灭或抑制卵囊形成的靶点，从而为鸡球虫病的防治提供新策略。本项目在建立了卵囊壁和成壁体分离纯化方法的基础上，提取了卵囊壁和成壁体总蛋白进行TMT标记蛋白质谱分析，获得了差异表达蛋白。经GO、KEGG和COG富集分析，获得了与卵囊壁形成相关的差异蛋白信息，并通过克隆表达和激光共聚焦免疫荧光定位技术进行了功能验证。通过蛋白组学分析，共筛选到差异蛋白1002个，其中，301个蛋白富集到29个GO条目中，599个差异蛋白富集到33个KEGG代谢途径中，391个蛋白被归类到21个COG簇中，且这些差异蛋白主要集中于细胞大分子复合物组装、蛋白质折叠，氧化还原酶复合物，二硫化物还原酶活性，辅酶生物合成过程，蛋白酶体复合物，过氧化物酶体等与翻译后修饰、蛋白质转换、碳水化合物运输和代谢等相关的功能。最后，筛选了EnGAM56和EnGAM59蛋白进行体外克隆表达，经免疫荧光定位显示，此2种蛋白均位于卵囊壁和成壁体中，经全自动Western blot分析显示，此2种蛋白均在卵囊壁中低表达，成壁体中高表达，与蛋白组学数据分析结果一致，预示成壁体蛋白参与了卵囊壁的形成。本项目研究结果为进一步解析卵囊壁形成的分子机制奠定了重要理论基础，也为鸡球虫亚单位疫苗的研制提供了候选基因。