硒通过硫氧还蛋白还原酶缓解奶牛乳腺上皮细胞氧化应激损伤的机理研究

Regulating and increasing the synthesis of thioredoxin reductase (TrxR) was an important measure to reduce oxidative injury of mammary gland of dairy cows. The program was conducted to elucidate the protective effects of selenium(Se) on oxidative injury induced by Diethylene Triamine-Nitric Oxide Polymer in bovine mammary epithelial cells(BMEC), and to discuss the regulation of Se on TrxR using in vitro experiment, and to determine the effects of Se on the NO production and the regulation of reducing TrxR activity on cytokine Interleukin(IL) production by using 2,4-dinitrochlorobenzene (DNCB) as inhibitor of TrxR. The activities and expressions of TrxR and inductible nitric oxide synthase by using DNCB as inhibitor of TrxR to induce the production of IL; or using IL-1Ra as antagonist of IL-1 receptor,or using relevant inhibitors to block mitogen-activated　protein　kinases (MAPKs) signal path and to discuss the mechanism for Se to attenuate oxidative injury of BMEC via TrxR-IL-NO pathway and TrxR-MAPKs-NO pathway modulated by TrxR according to phosphorylated　kinases related to MAPKs signal path and related gene expressions, contents and gene expressions of the related cytokine, inductible nitric oxide synthase. The study was further conducted to evaluate the mechanism for Se to attenuate BMEC oxidative injury via TrxR by siRNA-mediated TrxR gene silencing.

调节和提高奶牛乳腺上皮细胞（BMEC）中硫氧还蛋白还原酶（TrxR）的合成是减少乳腺氧化损伤的重要措施之一。以BMEC为模型，二乙烯三胺/一氧化氮聚合物为外源性NO供体，探讨硒对NO诱导的细胞损伤的保护作用及其对TrxR的调节作用。以2,4-二硝基氯苯（DNCB）抑制TrxR活性，探讨硒对NO生成的调节机理，及TrxR对白细胞介素类（IL）细胞因子的调节作用。以IL-1Ra为IL-1受体拮抗剂，或以相应的抑制剂阻断丝裂原激活蛋白激酶（MAPKs）信号通路，研究硒对TrxR活性、IL浓度、诱导型一氧化氮合酶和细胞凋亡信号激酶-1活性、MAPKs信号通路相关激酶磷酸化水平及其基因和蛋白质表达，以及NO 浓度的影响，从TrxR-IL-NO、TrxR-MAKPs-NO途径阐明硒对BMEC氧化应激损伤的保护作用。进一步通过siRNA沉默TrxR基因阐明硒通过TrxR缓解BMEC氧化应激损伤的机理。

调节和提高奶牛乳腺上皮细胞（BMEC）中硫氧还蛋白还原酶（TrxR）的合成是减缓奶牛乳腺氧化应激发生的重要措施之一。本项目以体外培养的BMEC为模型，以二乙烯三胺/一氧化氮聚合物（DETA/NO） 作为外源性NO 供体研究了硒对NO诱导的BMEC氧化损伤的保护作用及其对TrxR、白介素-1（IL-1）的调节作用；通过TrxR的抑制剂DNCB降低TrxR活性、IL-1受体拮抗剂（IL-1ra）抑制IL-1的作用，从TrxR-IL-NO途径探讨了硒对BMEC氧化损伤的缓解作用机理；通过丝裂原激活蛋白激酶（MAPKs）信号通路抑制、TrxR基因沉默与过表达等手段，从TrxR-MAPKs-NO途径诠释了硒促进抗氧化功能的分子机理。研究表明，1000 μmol/L DETA/NO作用6 h可引起BMEC产生明显的氧化应激；300 μmol/L DNCB作用2 h可引起细胞的氧化损伤。50nmol/L 的硒对DETA/NO 诱导的BMEC氧化损伤具有保护作用，并呈剂量依赖效应。硒可逆转由于DETA/NO或LPS氧化损伤引起的TrxR活性及其基因与蛋白表达量下调、炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α的浓度及其相关基因与蛋白表达量上调，导致iNOS活性降低进而减缓细胞的氧化应激；提示硒对细胞氧化损伤的减缓作用可能与TrxR活性升高导致的IL-1的分泌减少有关。硒和IL-1Ra单独或共同处理可以缓解DNCB诱导的BMEC氧化应激，ASK-1活性以及p38MAPK和JNK基因表达和蛋白磷酸化水平显著降低。通过SB203580或SP600125抑制p38MAPK和JNK信号通路的激活，对DNCB诱发的细胞氧化损伤起到显著的保护作用，Nrf2通路、TrxR活性及其基因与蛋白表达显著升高，而NO、炎症因子IL-1含量及其相关基因与蛋白质的表达量发生相反变化。说明TrxR对MAPKs信号通路的抑制作用是硒减缓细胞氧化应激损伤的关键。通过TrxR基因沉默与过表达试验进一步验证了TrxR1是硒减缓氧化BMEC氧化损伤的关键基因。即硒是通过Nrf2通路的激活促进了TrxR1的表达，从MAPKs-IL-1β-iNOS途径实现了硒对IL-1β诱导的iNOS-NO级联作用的抑制，从而降低了过量NO的生成，减缓了氧化应激。项目的完成对有效降低因氧化应激在奶牛生产中造成的负面影响具有重要的理论与实际意义。