LOXL2激活肿瘤相关成纤维细胞促进骨髓纤维化的机制研究

The dynamic evolution of bone marrow microenvironment is thought to be an essential factor to promote fibrosis progression in myeloproliferative neoplasms(MPN). We have previously found that the Lysyl Oxidase-like 2 (LOXL2) and Cancer-associated fibroblasts(CAFs) is closely related to the degree of myelofibrosis. Recent studies have found that solid tumors-derived LOXL2 directly activated fibroblast’s transformation to CAFs, and CAFs promoted to the disease progression by secreting multiple inflammatory cytokines remodeling the tumor microenvironment; Meanwhile, an enzyme that crosslinks collagen Loxl2 is essential for interstitial fibrosis. However, the function of LOXL2 and CAFs were not known. To further investigate their relationship in the progression of MPN, we want to study about how LOXL2 activates CAFs and how CAFs contribute to myelofibrosis through the remodeling of tumor microenvironment. Moreover, we should study the possible mechanism of CAFs mediated myelofibrosis by regulating LOXL2 gene in CAFs/leukemia cell coculture system and leukemia mouse model .This study will provide a new insight into MPN progression and design potential target drug.

骨髓微环境动态演化在骨髓增殖性肿瘤（MPN)纤维化进程中至关重要。申请人前期发现类赖氨酰氧化酶（LOXL2）及肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）活性蛋白与骨纤严重程度密切相关。最近在实体瘤研究中发现LOXL2刺激纤维母细胞向CAFs恶性转化，后者分泌大量炎性因子重塑肿瘤微环境推进疾病恶性进展，同时LOXL2促进基质胶原蛋白和弹性蛋白交联加速纤维化进程，成为目前研究热点，但其在MPN进展中作用机制尚不清楚。本项目拟在MPN病人及动物模型中研究LOXL2、CAFs表达分子与MPN克隆演化关系；并借助CAFs/白血病细胞共培养体系，通过CRISPR/Cas9技术调变LOXL2变化，研究LOXL2活化CAFs及后者重编程微环境促进纤维化机制。本项目将以全新的视角阐明骨髓微环境推进MPN纤维化进展机制，为MPN诊治提供新思路和新靶点。

进行性骨髓纤维化是MPN转化为白血病和骨髓衰竭的高危因素，但其机制目前仍不完全清楚。本研究在模拟乏氧环境下LOXL-2是否作为启动因素刺激MSC活化为CAF促进纤维化进程，并探索芦可替尼对LOXL2刺激MSC转化CAF是否有影响，此外本项目进一步研究MPN患者高通量检测与临床特征的相关性。本研究结果总结如下：.1.临床标本验证：临床标本水平检测发现α-SMA、FAP及LOXL2在骨髓纤维化患者中表达显著升高，骨髓活检免疫组化检测结果显示，a-SMA、FAP及LOXL2在正常人不表达或较低表达，随着纤维化程度的增加表达逐渐升高，在PMF严重纤维化患者中升高最显著。MPN患者MSC不同于正常人的生物学特征，其成骨分化能力增强、成脂分化能力减弱；a-SMA、FAP在MPN患者BMMSC中表达较正常人明显升高。.2.体外研究证实：模拟骨髓乏氧环境下LOXL-2通过FAK/Src信号通路刺激BMMSC活化为肿瘤相关成纤维细胞促进纤维化进程；LOXL-2抑制剂β-氨基丙腈显著抑制此效应。芦可替尼可能通过减少肿瘤细胞分泌LOXL-2，进而抑制MSC转化为肿瘤相关成纤维，获得稳定或改善骨髓纤维化的临床疗效。.3.动物体内发现：建立动物实验模型。检测成瘤时间、瘤细胞体积变化以及耐药性改变。验证LOXL2通过刺激肿瘤相关成纤维细胞活化FAK/Src信号通路介导耐药。.4.高通量测序发现：表观调节基因突变是MPN各亚型最常见的附加突变类型，MPN患者附加突变的异质性明显，PMF人均突变个数多于ET和PV，并发现13个少见基因突变，与MPNs的起病、发展或进展为白血病可能有关。.5.免疫蛋白芯片提示：PMF的T淋巴细胞亚群异常较ET和PV 更明显，JAK2的T淋巴细胞亚群异常较CALR更明显，无附加突变MPN的淋巴细胞亚群异常较有附加突变者更明显PMF患者的T淋巴细胞亚群、IL-8和VEGF存在明显异常，提示骨髓纤维化程度更高。.结论：研究LOXL2通过激活FAK/Src通路刺激MSCs转化为CAF，促进纤维化进程；我们还发现表观调节基因突变是MPN各亚型最常见的附加突变类型，PMF的T淋巴细胞亚群异常较ET和PV 更明显，显著骨髓纤维化患者的IL-8和VEGF表达明显升高。本研究为MPN诊治及机制挖掘提供新思路，具有重要科学意义。