miR-30和miR-1416/148家族对鸡感染空肠弯曲菌后SOCS3表达的选择调控机制

Campylobacter jejuni (C. jejuni) is one of the most important foodborne pathogens causing human bacterial diarrhea, and poultry is the main source of C. jejuni. Our previous studies have shown that expression of SOCS3， miR-30 and miR-1416/148 family are significantly changed and correlated after C. jejuni infection in chicken. However, it is not clear how those miRNAs selectively regulate SOCS3 following C. jejuni infection. In this proposal, chicken and chicken intestinal epithelial cell models infected by C. jejuni will be constructed, respectively. The expression of SOCS3 mRNA and SOCS3 protein will be detected at different time points and different tissues after C. jejuni infection using Quantitative PCR and Western blot, respectively. The selective regulatory model of SOCS3 by miRNAs will be constructed. The regulatory target sites of miRNA in SOCS3 genes will be predicted using bioinformatics and analyzed through dual luciferase report system. The expression of SOCS3 mRNA and protein altered by miRNAs inhibitors and mimics following C. jejuni infection will be detected in primary chicken intestinal epithelial cell. The expression of SOCS3 mRNA and protein regulated by miRNA SNP and isomiRs will be analyzed. The mechanism of SOCS3 gene selectively regulated by multiple miRNA after C. jejuni infection will be elucidated, and the molecular mechanism of single gene selectively regulated by multiple miRNA will be enriched. The findings will provide the theoretical and scientific basis to improve the genetic resistance to C. jejuni infection in chickens.

空肠弯曲菌是引起人细菌性腹泻最重要的食源性病原菌之一。家禽是空肠弯曲菌的最主要来源。前期研究表明SOCS3、miR-30和miR-1416/148家族在鸡空肠弯曲菌感染后存在表达相关性。然而对这些miRNAs选择性调控SOCS3表达的机制尚不清楚。本项目拟利用空肠弯曲菌感染鸡和鸡肠上皮细胞模型，用荧光定量PCR和Western blot分别检测感染后不同时间、不同组织中SOCS3 mRNA表达、miRNA表达和SOCS3蛋白表达，构建miRNAs对SOCS3的选择调控模式；利用双荧光素酶报告系统分析miRNA对SOCS3的靶向调控；分析miRNA沉默或过表达、SNP位点、异构体对SOCS3 mRNA和蛋白表达的调控；获得空肠弯曲菌感染后多个miRNA对SOCS3基因的选择性调控机制，丰富多个miRNA对单个基因精准调控的分子机制，为提高鸡对空肠弯曲菌感染的遗传抗性提供理论基础和科学依据。

空肠弯曲菌是引起人细菌性腹泻最重要的食源性病原菌之一。家禽是空肠弯曲菌的最主要来源。前期研究表明SOCS3、miR-30和miR-1416/148家族在鸡空肠弯曲菌感染后存在表达相关性。然而对这些miRNAs选择性调控SOCS3表达的机制尚不清楚。本项目构建了鸡空肠弯曲菌24小时节律性感染模型，分析了不同时间感染后各时间点SOCS3和gga-miR-30家族mRNA（包括gga-miR-30a、gga-miR-30b、gga-miR-30c、gga-miR-148a）在脾脏和法氏囊24小时的时序表达，利用双荧光素酶报告系统验证分析了SOCS3和miRNA的靶向结合关系，利用直接测序法分析了空肠弯曲菌感染群体中SOCS3基因SNP位点及对基因表达的影响。利用全转录组测序法检测了上午10:00接种后第8小时盲肠和脾脏全转录组，鉴定分析了空肠弯曲菌感染相关基因、miRNAs、miRNA异构体，lncRNAs、circRNAS等，利用荧光定量PCR检测m6A甲基化转移酶表达，利用新一代测序技术检测分析空肠弯曲菌后盲肠内容物微生物多样性等。结果发现不同时间感染空肠弯曲菌后血清免疫细胞因子呈现节律性变化，gga-miR-30a、gga-miR-30b、gga-miR-30c和gg-miR-148a对SOCS3基因的表达发挥选择性调控作用，且表达量与SOCS3基因表达呈相反趋势，双荧光素酶结果显示gga-miR-30a与SOCS3靶向关系不明显。上午10:00感染后第8小时有100个差异表达基因、164个显著差异LncRNA、32个显著差异表达miRNA、678个显著差异表达IsomiRs，主要集中在wnt 信号通路、昼夜节律信号通路等。M6A甲基化转移酶METTL3和METTL14的表达量显著受空肠弯曲菌感染的影响，且具有时间依赖性。微生物多样性结果显示10:00接种优势菌目为肠杆菌目（Enterobacteriales）梭菌目（Clostridiales），14:00接种优势菌目为乳酸杆菌目（Lactobacillales）、肠杆菌目（Enterobacteriales）、丹毒丝菌目（Erysipelotrichales），18:00接种优势菌目为假单胞菌目（Pseudomonadales）。研究结果为空肠弯曲感染的调控机制的深入了解提供依据，为鸡的抗病遗传育种提供参考。