特异靶向肿瘤早期预测因子：长链非编码RNA MALAT1正电子分子探针的研发及实验研究

The key reason of unsuccessful tumor therapy is its poor prognosis. It will be great significance in the early diagnosis, early prevention and cure of tumor recurrence if highly-selective, highly-specific positron emission tomography(PET) molecular probe, which target to tumor prognostic factor, can be developed. Long noncoding RNA (lncRNA) is a brand-new research focus, which has brought revolutionary change for the tumorigenesis and deveolpment. MALAT1 gene is related to tumor phenotype, highly expresses in the tumor issues and is closely related to the invasion, metastasis and prognosis of tumor. MALAT1 gene has been a prognostic factor and an important sign of poor prognosis. The study will based on our previous study: the expression of MALAT1 is closely related to the metastasis, proliferation and invasion of hepatic carcinoma; MALAT1 is a solo prognostic factor to predict hepatic carcinoma occurrence; MALAT1 antisense oligonucleotides (ASO) can combine the MALAT1 specifically, and is of time and concentration dependence, which possess the essential factor to develope PET probe. Further study is to develop the PET molecular probes which can specifically target to MALAT1, and screen out the specific molecular probes being of higher biologic activity. The developed PET molecular probes will have autonomic intellectual property.

肿瘤治疗的失败关键在于预后不良，如能研发高灵敏、高特异肿瘤早期预测肿瘤预后的正电子分子探针无疑对于肿瘤的早期防治、改善预后意义非凡。长链非编码RNA为目前肿瘤研究中全新热点，对肿瘤发生发展的认识带来革命性变化，MALAT1基因是与肿瘤恶性表型相关的长链非编码RNA，已证实其具有在肿瘤中异常高表达，与肿瘤侵袭转移、预后密切相关，尤其已成为肿瘤复发预测因子及预测疾病预后不良的重要指标。本课题拟在先期研究：MALAT1表达与肝癌预后转移复发，癌细胞增殖、迁移和侵袭力等恶性生物学行为密切相关；MALAT1过表达是预测肝癌术后复发的独立预后因子；MALAT1 ASO不仅特异靶向 MALAT1，而且具有时间、浓度依赖性等具备了正电子分子探针研发要素基础上，深入研发特异靶向MALAT1 的正电子小分子探针；并利用小动物PET技术筛选生物活性更优佳的特异分子探针。研发的正电子小分子探针将具有自主知识产权。

随着下一代测序技术的出现，人们对长非编码RNA(IncRNAs)的兴趣迅速增加。本研究第一部分首先研制合成了新型的IncRNA MALAT 1近红外光学分子探针，评价该光学成像探针的体外特性，并确定其能否用于体内恶性肿瘤组织中MALAT 1的表达。研究Cy5.5 -NHS酯与MALAT1 ASO偶联结合，用Glen-Pak DNA纯化盒和反相高效液相色谱法(HPLC)纯化标记的MALAT1 ASO。体外细胞摄取通过MHCC-LM3肿瘤细胞流式细胞仪分析结果表明，MHCC-LM3肿瘤细胞的结合随浓度的增加而增加，随培养时间的延长而增加。体内光学成像显示肿瘤内有5‘(Cy5.5)-MALAT1 ASO摄取，30 min时最大。随着时间的推移慢慢地被洗脱。4~48h与正常组织形成较高的对比。体内竞争实验显示，在任何时间点，肿瘤组织对探针摄取减少，说明在体内可进行有效竞争、探针结合具有肿瘤选择性。因此合成的MALAT 1 ASO Cy5.5分子影像剂可作为表达MALAT 1的肿瘤体内成像的一种有效的光学探针。第二部分拟研制新型的LncRNA MALAT 1 ASO正电子分子探针，评价其体外特性，并探讨其能否用于体内恶性肿瘤组织中MALAT 1的表达探针。首先合成NOTA- ASO前体，再合成68Ga-NOTA- ASO正电子分子显像剂，检测了MALAT1 ASO正电子分子探针体外稳定性及细胞摄取及阻滞实验，测定了药物药物代谢动力学，正常小鼠及荷MHCC-LM3瘤体内的生物分布及荷瘤鼠microPET研究。研究结果显示从前体采用一步法制备了68Ga-MALAT1 ASO正电子探针，平均放化产率为50%(未校正放射性衰变)，放射性纯度大于98%。静脉注射68Ga-MALAT1 ASO正电子探针显示了图像清晰质量高的小动物PET图像， 68Ga-MALAT1ASO正电子探针在肿瘤组织中的生物分布显示出较高的摄取率（30 min和60 min分别为3.04±0.11%ID/g，2.04±0.04%ID/g，60 min肿瘤/血液和肿瘤/肌肉比值分别为8.47±0.02，8.1725±0.12）。68Ga-MALAT1 ASO分子显像剂合成简便，体外稳定、放化纯度高，有望作为MALAT1高表达肿瘤的新型特异性分子探针，为进一步LncRNA领域分子探针深入研发奠定了坚实的基础。