肝硬化时影响骨髓内皮细胞功能的蛋白激酶的筛选

本课题组在临床实践中发现部分肝硬化患者的骨髓造血功能低于正常人，同时发现骨髓造血功能与患者术后效果呈正相关。为探讨其发生的分子机制，本课题拟利用骨髓内皮细胞和造血干细胞三维培养建立人工模拟骨髓造血微环境，用肝硬化患者的血清作用于人工模拟造血微环境，以液相芯片检测骨髓内皮细胞分泌细胞因子的改变，以造血干细胞功能基因芯片检测造血干细胞的功能；以激酶组学方法筛查骨髓内皮细胞中差异表达的蛋白激酶，并以蛋白激酶或其抑制剂进行干预，观察是否能改善骨髓造血功能。以期寻找在肝硬化时调节骨髓内皮细胞功能变化的蛋白激酶，为进一步从激酶水平改善肝硬化患者术前的骨髓造血功能奠定理论基础，为临床提高肝硬化手术治疗效果提供新的切入点。

背景：长期以来，肝硬化门静脉高压症一直是影响国民生存质量的一类严重疾病，经内，外科治疗往往预后不良。在慢性肝病，尤其是肝硬化患者中，贫血较为常见，据报道40—70%肝硬化患者患有血细胞减少，虽然多数患者是因为消化道出血或脾功能亢进造成血细胞破坏引起，但仍有部分患者并非上述两种情况。有学者在长期的实践研究中发现了肝硬化形成过程中骨髓造血功能发生了改变，为肝硬化患者血细胞减少的致病因素提供了新的研究线索。.主要研究内容：细胞因子PCR芯片检测骨髓内皮细胞分泌细胞因子的改变，以全基因组芯片，microRNA芯片筛查骨髓内皮细胞中差异表达的蛋白激酶，并以蛋白激酶或其抑制剂进行干预，观察是否能改善骨髓造血功能。.重要结果：本次实验中，肝硬化血清处理BMEC中的1106个高表达基因和766个低表达基因进行进一步分析筛选出差异表达的激酶基因14个，其中高表达9个（JAK3, GRK6, AKT1, PRKX, MYLK, CAMK2B, ERBB3, SRC, P38a），低表达5个（PDK1, RIPK3, CSNK2A1, EGFR, NTRK1）。KEGG分析显示这些激酶调控的重要通路在肝硬化时的骨髓内皮细胞中也差异表达。MicroRNA芯片实验结果显示372个microRNA表达异常；对差异表达的mRNA和microRNA进行调控网络分析后，筛选出差异的microRNA-mRNA作用对共31对，利用Real-time PCR验证4个microRNA（miR-29b、miR-650、miR-657、miR-92a）和它们的4个靶基因（CDKN1A、BCL2L11、PTEN、ING4），其结果与基因芯片的结果一致；对这23个差异表达的基因进行GO分析后，发现这些基因的功能主要集中在调控细胞凋亡方面，促进凋亡的基因高表达，抑制凋亡的基因低表达；流式细胞仪检测细胞凋亡率的结果显示肝硬化组骨髓内皮细胞的凋亡率（20.12±2.39%）高于对照组（9.68±1.28%）。.结论：肝硬化患者血清（即机体内环境的改变）影响骨髓造血微环境乃至影响骨髓造血功能，肝硬化时的体液因素是通过调节骨髓内皮细胞蛋白激酶（P38a）等来影响骨髓内皮细胞的功能。