Cx43介导的缝隙连接通讯网络在胶质瘤相关癫痫发病中的作用机制研究

Glioma-associated epilepsy (GAE) is a critical clinical issue that has an adverse impact on the life quality of glioma patients. Nowadays, the treatment of GAE is not satisfactory since the etiology of GAE is still elusive. Our preliminary data showed the marked astrogliosis in GAE patients and previous investigations indicated the activated intercellular gap junction communication (GJ) could aggravate astrogliosis. Besides, we also observed that the gene and protein levels of Cx43, a key molecule of GJ, were remarkably elevated in peritumoral tissues of GAE patients. Thus, we speculate that Cx43-mediated GJ is a very important mechanism underlying the occurrence of GAE. Our present work is intended to comprehensively study the role of Cx43-regulated GJ and its molecular mechanism in the generation of GAE via RNA interference, site-directed mutagenesis, CRISPR knock out, EEG recording, Patch clamp technique and Dye transfer coupling with cell co-cultures, animal models and brain slices. We attempt to disclose the novel mechanism for the pathogenesis of GAE and provide the theoretical evidence for developing new therapeutic approaches of GAE based on Cx43-mediated GJ network.

胶质瘤相关癫痫（GAE）是困扰胶质瘤患者的重要临床问题。因其发病机制不明，目前该类癫痫缺乏有效的治疗手段。我们团队新发现，GAE患者瘤周组织存在星形胶质细胞反应性增生（astrogliosis）。既往研究显示激活缝隙连接（GJ）通讯可以加重astrogliosis，而GJ通讯的关键分子Cx43在GAE患者瘤周组织中的表达显著上调。据此，我们提出“Cx43介导的GJ通讯是GAE发生的重要机制”的科学问题。本项目拟在细胞、动物和脑片多个水平上，联合运用RNA干扰、定点突变、CRISPR敲除、脑电图测定、膜片钳及Dye transfer coupling等多种技术手段，系统研究Cx43调控GJ通讯在GAE发病中的作用及其分子机理。通过该研究，我们试图建立GAE中GJ通讯网络的新概念，揭示GAE发生的新机制，为开发基于Cx43介导的GJ通讯网络的新型抗GAE药物提供理论依据。

胶质瘤相关癫痫（GAE）在胶质瘤患者中普遍存在。然而其发病机制目前尚不清楚。本项目首先基于GAE临床样本脑组织中发现缝隙连接（GJ）通讯的关键分子connexin 43（Cx43）基因和蛋白表达显著上调。为了进一步探索Cx43介导的GJ通讯在GAE中的调控机制，我们通过细胞共培养平台利用RNA干扰或定点突变技术证实胶质瘤细胞中的Cx43表达对GJ通讯至关重要，且使用JNK抑制剂（SP600125）或ERK抑制剂（PD98059）干预后，c-Jun磷酸化和c-Fos（AP-1的两种亚型）蛋白表达显著降低。敲减c-Jun或c-Fos后，胶质瘤细胞中Cx43表达显著降低。敲减胶质瘤细胞中Cx43后，c-Src磷酸化显著增加。这提示胶质瘤可能首先触发JNK-ERK-AP-1信号进而激活Cx43的表达；表达增加的Cx43抑制c-Src的活性从而增强GJ通讯功能。在成功构建的GAE动物模型中，为了进一步明确Cx43与GAE发病之间的关系，我们合成了针对胶质瘤细胞的穿膜Cx43阻断肽并进行干预，结果表明Cx43阻断肽可显著抑制GAE发作。此外，在GAE动物模型中，替莫唑胺（TMZ）和GJ抑制剂生胃酮（CBX）或18-α-甘草次酸（18-α-GA）显著降低GAE发作评分，提示TMZ或GJ通讯抑制剂CBX或18-α-GA对GAE发作具有明显抑制作用。总之，本研究建立了GAE发病中GJ通讯网络的新概念，靶向JNK-ERK-AP-1-Cx43-c-Src信号轴介导的GJ通讯可能是GAE治疗的新策略。另外，在本项目的实施过程中，我们意外发现GAE动物模型中存在新型细胞死亡（铁死亡）的直接证据，即GAE模型中铁死亡标志物Ptgs2 mRNA表达显著上调且铁死亡抑制剂显著抑制GAE发作，提示铁死亡激活可能是GAE发病的另一重要机制。为了阐明GAE中GJ通讯是否与铁死亡通路有关，在GAE动物模型中，我们使用GJ通讯抑制剂CBX或18-α-GA干预。结果表明，CBX或18-α-GA显著抑制了GAE模型中的铁死亡，提示GJ通讯可能通过激活铁死亡诱发GAE。我们在神经细胞铁死亡模型（Glu诱导的HT22细胞损伤）中也验证了CBX或18-α-GA确实可以抑制铁死亡。这些研究结果对于深入解析GJ通讯在GAE发病中的作用具有重要意义。