A型GABA受体γ2亚基（GABAAR γ2）的磷酸化修饰在丙戊酸钠抗癫痫中的作用

The tyrosine phosphorylation of GABAAR γ2 subunit plays a critical role in modulating GABAAR function, but whether it can influence the anti-epileptic potential of sodium valproate (VPA) remains elusive. It was previously reported that VPA exerted anti-epileptic role via enhancing GABAAR-mediated synaptic transmission. Thus, we speculate that the tyrosine phosphorylation of GABAAR γ2, which contributes to the reinforcement of GABAergic neurotransmission, is involved in the suppression of epileptic seizures by VPA. In the present study, Patch Clamp technique was firstly employed to detect GABAAR-mediated miniature inhibitory postsynaptic conductance (mIPSC) and evoked inhibitory postsynaptic conductance (eIPSC) of the epileptic cell model, which was successfully established previously by our group. We then investigated the effect of VPA on the tyrosine phosphorylation of GABAAR γ2 by Patch Clamp technique and Western blot. Finally, the potential mechanism that regulates the tyrosine phosphorylation of GABAAR γ2 by VPA was explored in the occurrence of seizures. Our investigation will further confirm the critical role of the tyrosine phosphorylation of GABAAR γ2 in the maintenance of GABAAR function and provide a mechanical explanation for the anti-epileptic action of VPA.

GABAAR γ2的酪氨酸磷酸化修饰对于调节GABAAR功能至关重要，但是它在丙戊酸钠抗癫痫中的作用尚不清楚。以往的研究表明，丙戊酸钠的抗癫痫作用和增强GABAAR介导的抑制性突触传递有关。因此，我们推测丙戊酸钠的抗癫痫作用可能通过调控GABAAR γ2的酪氨酸磷酸化修饰从而增强GABA能抑制性突触传递作用。本研究我们首先利用成功建立的癫痫细胞模型通过膜片钳技术证实丙戊酸钠对癫痫发生过程中GABAAR介导的mIPSC和eIPSC有影响。然后使用膜片钳技术和Western blot技术检测丙戊酸钠对癫痫发生过程中GABAAR γ2酪氨酸磷酸化的影响。最后阐述丙戊酸钠调控癫痫中GABAAR γ2酪氨酸磷酸化的可能机制。本课题将进一步明确GABAAR γ2的酪氨酸磷酸化修饰在GABAAR功能维持中的重要作用，同时为丙戊酸钠的抗癫痫作用提供新的机制性解释。

丙戊酸钠（Sodium valproate，VPA）是临床上最常见的抗癫痫药物之一。其抗癫痫作用可能与增强A型γ氨基丁酸受体（A type gamma aminobutyric acid receptor，GABAAR）介导的抑制性突触传递作用有关，但其具体的分子机制尚不明确。本项目在无Mg2+及谷氨酸诱导的癫痫细胞模型上发现，GABAAR γ2亚基的327位的关键丝氨酸位点蛋白的磷酸化（p-GABAAR γ2 S327）显著降低。同时在匹鲁卡品及海人酸诱导的癫痫动物模型上也证实了同样的结果。而使用VPA干预后，p-GABAAR γ2 S327表达在上述四种癫痫模型上均显著增加。而且，无Mg2+诱导的癫痫细胞模型中经VPA处理后，GABAAR介导的mIPSC和eIPSC显著增强。为了进一步探索VPA增强p-GABAAR γ2 S327的分子机制，我们利用无Mg2+及谷氨酸诱导的癫痫细胞模型，检测了蛋白激酶C（PKC），蛋白激酶A（PKA），CAMKⅡα和CMAKⅡβ的活性。我们的研究结果表明，无Mg2+诱导的癫痫细胞模型经VPA处理后，PKC的活性（PKC的磷酸化蛋白表达）显著增强。更有意思的是，在无Mg2+及谷氨酸诱导的癫痫细胞模型中，抑制蛋白激酶C（PKC）的活性后，VPA对p-GABAAR γ2 S327表达明显受到抑制。与此同时，阻断PKC的活性后，VPA对无Mg2+诱导的癫痫细胞模型中增强的mIPSC和eIPSC受到逆转，提示VPA的抗癫痫作用可能通过增强PKC介导的p-GABAAR γ2 S327来实现。总之，我们的研究结果发现，癫痫发生过程中p-GABAAR γ2 S327显著降低，而VPA可能通过增强PKC介导的p-GABAAR γ2 S327来发挥抗癫痫作用，这为VPA的抗癫痫作用提供了一种新的机制性解释，同时也为针对这一靶点开发新型高效低毒的抗癫痫药物提供可靠的理论依据。