Dlk1-Dio3印记簇长非编码RNA在小鼠早期胚胎发育中的功能研究

The long non-coding RNAs (lncRNA) is a class of non-protein-coding RNA molecules, which participate in the regulation of gene imprinting and embryonic development, has increasingly become the forefront of RNA research. However, there is a lack of relevant research on expression patterns and functions of lncRNA in preimplantation development. Subject to the mouse Dlk1-Dio3 imprinting cluster model, we will study expression patterns and functions of the cluster of three main lncRNA-Gtl2, Rian and Mirg, during early mouse embryogenesis. First, we will make it clear in expression patterns of them and the dynamic changes of the differentially methylated regions(DMR) in the imprinted cluster during preimplantation development. Second, we found these lncRNA only expressed in the morular and blastocyst stage，while not in 8-cell stage and before in previous experiments. Thus, we intend to over-express lncRNA in the 8-cell embryo and knockdown it in the blastocyst to detect the DNA differentially methylated regions and histone epigenetic modification, and evaluate its effect on early embryogenesis. So, we can further clarify the long non-coding RNA in imprinting regulation and role in embryonic development, and provide a theoretical basis on related research.

长非编码RNA（lncRNA）是一类不编码蛋白的RNA分子，参与基因印记和胚胎发育调控，已日渐成为RNA研究领域的前沿热点。但对于lncRNA在着床前胚胎发育中的表达和功能，目前还缺乏相关的研究。本课题以小鼠Dlk1-Dio3印记簇为研究模型，针对此印记簇三个主要的lncRNA-Gtl2、Rian和Mirg在胚胎早期的表达模式和功能展开研究。首先，明确其在着床前胚胎发育阶段的表达模式及印记簇差异甲基化区(DMR)的动态变化；其次，通过我们前期的实验发现，这些lncRNA只在桑、囊胚期表达，而在8-细胞期前不表达。因此我们拟设计在8-细胞中的过表达实验和在囊胚中的RNA干涉实验，从正反两方面研究这些lncRNA与差异甲基化区及相关组蛋白表观修饰之间的调控关系，并评估其对胚胎早期发育的影响。从而进一步明晰lncRNA在印记调控以及胚胎发育中的功能，为相关研究的开展提供理论基础。

项目的背景：.Dlk1-Dio3印记簇非编码RNA与诱导多能干细胞iPSC的多能性存在密切关系，已有研究发现此区间长非编码RNA（lncRNA）的表达水平对于iPSC细胞的全能性尤为重要。由于iPSC细胞具有胚胎干细胞特征，而ESC细胞又是来源于早期胚胎囊胚阶段的内细胞团细胞，提示这些lncRNA在早期胚胎中很可能也存在表达并具有功能，而目前缺乏相关研究。.主要研究内容：.（1）Dlk1-Dio3印记簇主要的lncRNA（Gtl2、Rian和Mirg）在早期胚胎的表达模式及调控机制；.（2）这些lncRNA对早期胚胎发育能力及细胞命运决定的影响；.（3）Dlk1-Dio3印记簇一个新lncRNA AK044800在胚胎中的表达模式和印记鉴定的研究。.重要结果：.（1）Gtl2、Rian和Mirg在早期胚胎8-cell及之前的各时期均不表达，桑椹胚期起始表达，并在囊胚期表达升高。随着桑椹胚囊胚的发育，Gtl2的表达逐渐集中于内细胞团细胞，而在滋养层细胞中消失。Gtl2在桑椹胚期的表达激活可能与激活组蛋白修饰H3K4me3的上升有关，并可能受到核心干细胞转录因子Oct4、Sox2和Nanog的调控。.（2）Gtl2的表达下调不影响囊胚发育率，但囊胚的后期发育能力受到显著削弱；Oct4的表达显著下调，但对Sox2、Nanog和Cdx2表达的影响不大。通过2-cell单卵裂球跟踪实验发现，Gtl2抑制的胚胎细胞都会分化为滋养层细胞，而不能成为内细胞团细胞。而Gtl2过表达对胚胎细胞的命运决定无显著影响。.（3）lncRNA AK044800在胚胎脑中特异性表达，且具有品系选择性，其在DBA品系小鼠中特异性表达沉默，但非印记表达。.科学意义：.本研究对Dlk1-Dio3印记簇主要lncRNA在早期胚胎的表达模式、调控机制及分子功能进行了详细的研究。首次发现了Gtl2、Rian和Mirg在早期胚胎中独特的时空表达模式，以及Gtl2的表达下调导致胚胎细胞分化为滋养层细胞。另外，在此印记簇首次发现了一个品系选择性的脑特异性表达的非印记表达的lncRNA AK044800。本研究的开展丰富了人们对lncRNA的认识，尤其在早期胚胎中对Gtl2表达调控和功能的深入研究，有助于揭示Gtl2与干细胞多能性之间的关系，为诱导多能干细胞iPSC等的机制研究提供理论基础和新的视角。