NSP4在轮状病毒致鼠胆管损伤中的作用及机理研究

我们以前的研究发现非结构蛋白4（NSP4）在轮状病毒致胆道闭锁中起重要作用，但其机理不明。本课题拟用轮状病毒的NSP4注射正常和CD8+淋巴细胞剔除新生鼠，分析新生鼠胆管损伤的程度及观察致敏CD8+淋巴细胞对胆管上皮细胞的杀伤作用，直接证实CD8+淋巴细胞在NSP4致胆管上皮细胞损伤中的作用。同时采用生物信息学的方法预测NSP4若干CTL表位，合成这些"表位肽"，并注射至新生鼠，获取肝脏及脾脏中CD8+淋巴细胞，然后观察致敏CD8+淋巴细胞对胆管上皮细胞的杀伤效应，同时采用酶联免疫斑点试验和胞内细胞因子染色检测淋巴细胞IFN-γ表达，了解致敏CD8+淋巴细胞的CTL活性，从而确定NSP4 中的CTL表位。通过以上研究，有望首次明确NSP4引起胆管损伤的机理，为通过免疫干预降低胆道闭锁的发生奠定基础。

我们以前的研究发现非结构蛋白4（NSP4）在轮状病毒（RRV）致胆道闭锁中起重要作用，但其机理不明。本研究对NSP4及其表位肽导致胆管损伤的机制进行进一步研究并明确其CTL表位。本课题对出生后12小时内的新生鼠腹腔注射表达纯化的NSP4及固相多肽合成法合成的表位肽，第7天行HE染色观察肝外胆管的损伤程度，并于腹腔注射后第7、14天用酶联免疫斑点法检测肝脏淋巴细胞释放的IFN-γ，胞内细胞因子染色法检测肝脏CD8+淋巴细胞释放的IFN-γ，ELISA法检测外周血清IFN-γ的含量，流式细胞术检测记忆CD8+淋巴细胞，用乳酸脱氢酶释放法检测CD8+淋巴细胞对培养的肝外胆管上皮细胞(感染RRV与未感染RRV组)的杀伤程度，并研究TLR所起的作用及剔除CD8+淋巴细胞后肝脏淋巴细胞及外周血清释放IFN-γ的情况，同时用表达纯化的NSP4及合成的表位肽和佐剂腹腔注射孕鼠后再对其新生鼠腹腔注射RRV，于7天后行HE染色观察小鼠肝外胆管的损伤程度及胆道闭锁的发生率。实验结果发现NSP4可导致小鼠肝外胆管发生部分梗阻，酶联免疫斑点、胞内细胞因子染色、外周血清ELISA检测到NSP4组及表位肽NSP4157-170和NSP4144-152组释放的IFN-γ含量大于对照组（P＜0.05），细胞杀伤实验结果表明NSP4组及表位肽NSP4157-170和NSP4144-152组的CD8+淋巴细胞对胆管上皮细的杀伤效应明显强于对照组（P＜0.05），且对感染了RRV的肝外胆管上皮细胞的杀伤效应强于未感染RRV组；TLR2/4在胆管损伤中均起作用，剔除CD8+T淋巴细胞后肝脏淋巴细胞及外周血清释放的IFN-γ含量明显降低（P＜0.05），孕鼠腹腔注射NSP4及表位肽和佐剂后的新生鼠腹腔注射RRV后胆道闭锁发生率明显降低。本研究表明轮状病毒NSP4介导的CD8+T淋巴细胞引起的细胞免疫反应在胆管损伤中具有重要作用，其中表位肽NSP4157-170和NSP4144-152可能是轮状病毒NSP4的CTL表位。