基于TFAP2E甲基化水平构建的智能型双药协同纳米投递系统在胃癌治疗中的应用与评价

How to improve chemotherapy efficient, reverse drug resistance and reduce side effects are urgent problems need to be solved in gastric cancer treatment. Recently study demonstrated that hypermethylation of TFAP2E gene was correlated with non-responsiveness to the commonly used chemotherapeutic agent 5-fluorourail (5-Fu). A chemical 5-aza-2-deoxycytidine (5-Aza-dC) has been used to inhibit DNA methylation and improve efficiency of 5-Fu chemotherapy. This project is designed to use a kind of PEG-Pep-PCL nanoparticles co-deliver 5-Aza-dC/5-Fu to gastric cancer cells. The nanoparticles can be cleaved by MMP2/9 which are specially expressed in most tumor tissues. Thus, 5-Aza-dC/5-Fu will be targeting delivered to tumor tissues and get more antitumor efficiency than 5-Fu itself. The ration of gene methylation and antitumor efficiency will be evaluated in vitro and in vivo. We are hoping the project will provide scientific evidence for clinical application of the novel drug delivery system for gastric cancer.

提高胃癌化疗疗效、逆转耐药并降低化疗毒副作用是临床迫切需要解决的问题。本项目在申请人所在课题组前期成功构建明胶酶（MMP2/9）靶向纳米载体并已获得国家发明专利的基础上，以最新研究发现甲基化抑制剂5-Aza-dC可改变TFAP2E基因高甲基化状态，抑制氟尿嘧啶类耐药基因表达，从而增加5-Fu 的抗肿瘤效果为依据，构建具有明胶酶靶向的5-Aza-dC/5-Fu双药纳米粒子。并通过建立胃癌TFAP2E高甲基化和低甲基化的原位和转移性肿瘤模型来模拟人体原发肿瘤的生物学特性，研究该纳米载药体系对肿瘤基因甲基化水平的影响及对肿瘤的控制作用及可能的分子机制，明确其作为一种新型的协同靶向药物控释体系在胃癌治疗中的价值，也为靶向载体药物向临床应用过渡提供科学依据。

甲基化抑制剂5-杂氮-2-脱氧胞苷（5-Aza-2-deoxycytidine，DAC）可改变TFAP2E基因高甲基化状态，抑制5-FU耐药基因表达，显著提高5-FU的抗肿瘤效果、逆转耐药。但是DAC作为一种泛甲基化抑制剂，对全基因组都具有很强的去甲基化作用，作用于正常组织会产生严重的毒副反应，同时由于DAC本身的不稳定性、生物利用度差等缺点也限制了其在体内的应用。本项目通过两次酰胺法和开环聚合法合成具有明胶酶底物肽段的高分子纳米靶向载体，负载5-FU及DAC形成DAC/5-Fu双药明胶酶靶向载体。全面检测其粒径、均一性、载药量、稳定性等多项理化性质。通过筛选，获得高甲基化和低甲基化TFAP2E的人胃癌细胞株。通过体内外实验研究该纳米载药体系对TFAP2E表达水平的影响及对肿瘤的抑制作用和可能的分子机制。研究显示，明胶酶靶向纳米粒子具有良好的均一性与稳定性。MTT检测及凋亡检测结果均显示双药纳米粒子对于TFAP2E高甲基化细胞具有更好的抗肿瘤特性。通过进一步的机理研究，发现DAC/5-FU双药酶靶向纳米粒子可上调TFAP2E高甲基化细胞的TFAP2E表达水平，与之相应的是降低DKK4的表达水平。而对于TFAP2E低甲基化的细胞，在DAC/5-FU双药酶靶向纳米粒子的作用前后，TFAP2E和DKK4的表达水平未出现明显的差异。在体外实验的基础上，体内实验也显示，DAC/5-FU双药酶靶向纳米粒子与游离DAC、5-FU单独及联合给药相比，具有更好的抗肿瘤效果。采用酶靶向纳米粒子后，肿瘤部位的粒子分布会提高。而毒性实验显示，与对照组相比，靶向粒子未表现出明显的毒副作用。明胶酶靶向载体，具有安全低毒的特性。而且可以将DAC/5-FU稳定的送达肿瘤组织，提高药物的抗肿瘤特性。通过明胶酶靶向载体这一平台的搭建，后续可选择不同的抗肿瘤药物及针对不同肿瘤选择靶标，为后续研究开拓了一个新的领域。