LOXL2/GATA6复合体上调VEGF-A转录促进胆管癌血管生成的分子机制

Angiogenesis is a hallmark of cancer. Our previous study has demonstrated that LOXL2 promotes angiogenesis through upregulating VEGF-A in cholangiocarcinoma. However, the relative mechanism is unknown. Our preliminary work showed that (1) LOXL2 could bind with GATA6 in cholangiocarcinoma by IP, (2) Bioinformatics analysis indicates potential GATA6 binding site existes in the promoter region of VEGF-A gene, (3) the mRNA level of VEGF-A was significantly increased by overexpressed of GATA6. Thus, we postulates that LOXL2 might bind with GATA6 to form a protein complex and then upregulates VEGF-A expression in cholangiocarcinoma. In the presrnt study, we try to demonstrate the above postulation by lentivirus transfection, real-time PCR, western-blot, luciferase reporter gene assay, deletion mutations, point mutations, electrophoretic mobility shift and chromatin immunoprecipitation assay in vitro and in vivo. The aim of this study is to demonstrate the mechanism of LOXL2/GATA6 complex promoting angiogenesis in cholangiocarcinoma cells, and provide more research evidences for clinical anti-angiogenesis therapy.

持续的血管生成是恶性肿瘤的重要生物学特征，是医学研究的重点。在NSFC的资助下，我们研究发现LOXL2在胆管癌侵袭与转移中扮演重要角色，还可以通过调控VEGF-A促进血管生成，但机制不明确。我们前期工作发现：在胆管癌细胞中，LOXL2能与转录因子GATA6结合；生物信息学预测发现VEGF-A启动子含有GATA6结合位点；上调GATA6后VEGF-A mRNA显著升高。结合既往文献报道及前期结果，我们推测：LOXL2与GATA6结合形成复合体，上调VEGF-A的转录表达，进而促进胆管癌血管生成。本研究拟在临床标本、动物实验、细胞实验等水平，通过免疫组化、免疫荧光、慢病毒转染、裸鼠活体种植、荧光素酶报告基因实验、ChIP、EMSA、点突变等方法，研究LOXL2/GATA6复合体调控VEGF-A的分子机制及其在胆管癌血管生成中的作用，为临床胆管癌病人的抗血管生成治疗筛选潜在靶点提供新思路。

胆管癌（CCA）是仅次于肝细胞癌的第二常见肝胆系统肿瘤，预后差，其总体发病率在世界范围内呈上升趋势。更好地深入了解CCA的分子特征和生物学行为将有助于寻找新的分子靶点治疗CCA。血管生成已成为恶性肿瘤的一个公认标志。肿瘤通过生成的血管提供营养和氧气维持迅速的生长和转移。血管内皮生长因子A（VEGFA）在肿瘤血管生成中起着关键作用。抗血管生成治疗已被临床应用于各种实体瘤，包括CCA。尽管如此，抗血管生成治疗对癌症的临床疗效仍不令人满意，而且临床副作用、细胞毒性、耐药和患者复发率均较高。因此，迫切需要理解血管生成的新机制。GATA结合蛋白6（GATA6）是GATA结合蛋白家族的一员，在胚胎发育期间GATA6对心血管系统、消化系统和其他组织的增殖、分化和发育至关重要。GATA6的过度表达可促进胃癌、结直肠癌、乳腺癌以及胆管癌的进展。一些研究表明GATA6与肿瘤血管生成有关，但其分子机制尚未研究。赖氨酰氧化酶样蛋白2（LOXL2）是细胞外基质（ECM）修饰酶LOX家族的成员。已有研究表明，核内LOXL2可与某些转录因子协同调节上皮间质转换（EMT），促进肿瘤转移。此外，靶向抑制LOXL2可降低肿瘤和眼科疾病的血管生成。然而，在CCA中LOXL2的血管生成机制尚未研究。在我们的学习中，我们使用生物信息学分析表明GATA6可能与VEGFA的启动子区域结合。我们证实了GATA6转录调控了VEGFA的表达，并阐明了一种新的CCA血管生成机制，LOXL2与GATA6结合，上调VEGFA的表达，促进CCA血管生成和肿瘤生长。因此，筛选LOXL2小分子细胞渗透性抑制剂治疗CCA以及患者分层的预后标记候选可能具有很大的价值。