原肌球调节蛋白1在AQP2介导的肾脏集合管水重吸收中的作用及机制研究

Water balance in human body is determined by water reabsorption of renal collecting duct, which is mediated by the targeting of aquaporin2 (AQP2) onto the apical membrane via trafficking. Among the mechanisms that regulate AQP2 trafficking, cytoskeleton plays an important role. Recently, we discovered that a cytoskeletal protein, Tropomodulin1 (Tmod1), was specifically expressed in collecting duct. Tmod1+/- mice display a defect in urine concentration and a decrease in membrane localization of AQP2. Based on literatures and these results, we hypothesize that Tmod1 enhances the water reabsorption of collecting duct and regulates the water homeostasis by affecting AQP2 trafficking and promoting its membrane accumulation. To test our hypothesis, we will create kidney-specific Tmod1 knockout mice and utilize metabolic cages, molecular biology techniques, and protein mass spectrometry, etc. By performing both in vivo and in vitro experiments, we are aimed to define the role of Tmod1 in water reabsorption of renal collecting duct; to investigate whether Tmod1 could regulate the cellular localization of AQP2 and water permeability of cells by affecting AQP2 exocytosis and / or endocytosis; to elucidate how Tmod1 regulates AQP2 trafficking by interacting with other proteins. Our project will enhance our understanding on the mechanisms that regulates AQP2 trafficking. It will also provide new targets for people to treat various diseases characterized by disordered water balance.

肾脏集合管水的重吸收决定着机体的水平衡，水通道蛋白AQP2通过转运而定位于顶端膜则介导了这一过程。在影响AQP2转运的机制中，细胞骨架有重要作用。我们新发现，一种骨架蛋白-原肌球调节蛋白1（Tmod1）在集合管特异表达，Tmod1+/-小鼠有尿浓缩障碍且AQP2胞膜定位减少。由此提出假说：Tmod1通过影响AQP2的转运而促进AQP2在顶端膜上的聚集，以增加集合管对水的重吸收，进而调节机体的水平衡稳态。我们拟利用Tmod1肾脏特异性敲除小鼠、代谢笼、分子生物学技术和蛋白质质谱技术，通过体内和体外实验，明确Tmod1在集合管水重吸收中发挥的作用；验证Tmod1通过影响AQP2的胞吐和/或胞吞，调节AQP2的定位和细胞对水的通透性；阐明Tmod1如何通过与其它蛋白的相互作用而调节AQP2的转运。本课题将加深人们对AQP2转运调节机制的理解，并为治疗以水平衡失调为特征的多种疾病提供新的药物靶点。

肾脏集合管对水的重吸收调节着机体的水平衡，水通道蛋白2（Aquaporin2，AQP2）从胞浆到胞膜的转运则介导着这一过程。有证据表明，细胞骨架蛋白在调节AQP2的转运中发挥重要作用。本课题以细胞骨架蛋白--原肌球调节蛋白1（Tropomodulin1，Tmod1）为切入点，研究Tmod1对AQP2转运和机体水平衡的影响及其机制。免疫组化结果显示，Tmod1在小鼠肾脏中表达且定位于远曲小管和集合管。qPCR和蛋白免疫印迹结果显示，在小鼠肾脏和皮质集合管细胞系M-1细胞中，Tmod1的表达不受禁水或血管加压素AVP的影响；而在原代内髓集合管（IMCD）细胞中，Tmod1在高渗透压刺激下表达上调。对胞膜和胞浆蛋白的分析表明，禁水或AVP处理后Tmod1在胞膜上的分布增加，而胞浆中的分布减少，水负荷时则有相反的变化。在原代IMCD细胞中，Tmod1可引起AQP2表达上调和S256位点的磷酸化水平增加。在稳定表达AQP2的M-1细胞中，Tmod1可促进AQP2在胞膜上的定位，且增加细胞膜在低渗溶液中对水的通透性。我们构建了肾脏特异的Tmod1条件敲除小鼠，利用代谢笼测量发现，与对照小鼠相比，敲除小鼠表现出尿量减少、尿渗透压增加和血压升高。而Tmod1+/-小鼠则在禁水后出现尿量增加、尿渗透压下降，以AQP2在胞膜上定位的减少。对Tmod1条件敲除小鼠肾脏的蛋白质组学和生物信息学分析结果表明，Tmod1与蛋白磷酸化、代谢过程和多个信号通路密切相关。通过免疫共沉淀结合蛋白质质谱分析，我们发现了多个在M-1细胞内与Tmod1可能存在相互作用的蛋白。免疫共沉淀结果证明Tmod1与细胞周期蛋白依赖激酶1（CDK1）存在相互作用。同时，Tmod1能促进CDK1的表达，而CDK1的抑制剂能阻断Tmod1引起的AQP2-S256的磷酸化。我们的研究表明，Tmod1可能通过与CDK1的相互作用，促进AQP2的磷酸化和AQP2从胞浆到胞膜的转运，调节肾脏集合管对水的重吸收，从而在机体的水平衡调节中起重要作用。这提示Tmod1可能是防治以水平衡失调为特征疾病的新干预靶点。