Tmod1在oxLDL和基质硬度联合诱导的巨噬细胞生物力学改变中的作用及分子机制研究

The migration inhibition is the core event in the development of atherosclerosis. Oxidized low density lipoprotein (oxLDL) and matrix stiffness of the blood vessel are two major determinants for it. The cytoskeletal proteins regulate the mechanical properties and migration of cells. Recently, we found that a cytoskeletal protein, Tropomodulin1 (Tmod1), mediated the synergistic effect of oxLDL and matrix stiffness on the macrophage mechanics. Importantly, Tmod1 was found regulate the expressions of oxLDL receptor, CD36, and the mechanosensor, integrin. Therefore, we hypothesize that Tmod1 participates the mechanical regulation of oxLDL and matrix stiffness by promoting the cooperation of CD36 and integrin signaling pathways, thus accelerates the development of atherosclerosis. To test our hypothesis, we will use biomechanical, molecular and biological techniques and utilize our Tmod1-/- mouse and a mouse model with high blood vessel stiffness. We will identify the role of Tmod1 in the mechanical alterations in macrophages caused by oxLDL and matrix stiffness. Then we will investigate how Tmod1 affects the CD36 and integrin signaling pathways and their cooperation. Finally, by manipulating the blood lipid and blood vessel stiffness in animals, we will study the role of macrophage Tmod1 in the development of atherosclerosis. This project will provide us new ideas for preventing atherosclerosis from the viewpoint of biomechanics.

巨噬细胞的迁移抑制是动脉粥样硬化发生发展的核心事件，氧化低密度脂蛋白（oxLDL）和血管基质硬度是其影响因素。骨架蛋白调节细胞力学性质和迁移。我们新发现，一种骨架蛋白-原肌球调节蛋白1（Tmod1）介导oxLDL和基质硬度对巨噬细胞力学性质的协同作用，且调节oxLDL受体CD36和力学感受器整合素的表达。由此提出假说：Tmod1通过促进CD36和整合素信号通路的协同作用，参与oxLDL和基质硬度联合作用对巨噬细胞力学特性的调节，加速动脉粥样硬化发生发展。我们拟利用生物力学、分子生物学技术、Tmod1-/-小鼠和高血管硬度模型小鼠，验证巨噬细胞中Tmod1对oxLDL联合基质硬度引起的细胞力学改变的影响；阐明Tmod1如何影响CD36、整合素及其通路间的协同作用；在体内验证血脂和血管硬度改变时巨噬细胞的Tmod1对动脉粥样硬化的影响。本研究将从生物力学的角度为动脉粥样硬化提供新的防治思路。

巨噬细胞的迁移抑制是动脉粥样硬化发生发展的核心事件，而氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）和血管基质硬度是其重要的影响因素。本研究以细胞骨架蛋白Tmod1为切入点，研究oxLDL和基质硬度影响巨噬细胞力学特性和动脉粥样硬化发展的分子机制。利用Western blot和免疫荧光染色，我们发现与对照血管相比，在高血脂和高血管硬度诱导的人和小鼠动脉粥样硬化斑块中的Tmod1的表达显著升高。在小鼠Raw264.7巨噬细胞和小鼠腹腔巨噬细胞中，我们发现oxLDL和高基质硬度均能上调Tmod1的表达。利用LDLR-/-和具有高血管基质硬度的ApoE-/-小鼠和骨髓移植实验，我们证明巨噬细胞中Tmod1的缺失能显著抑制高血脂和高基质硬度诱导的动脉粥样硬化的发生，同时发现血管基质硬度较高脂饮食喂养对动脉粥样硬化的形成更重要。在体外实验中，我们发现Tmod1的缺失能显著抑制oxLDL引起的巨噬细胞胆固醇聚集，消除oxLDL对巨噬细胞迁移的抑制作用和促伸展作用。同时，Tmod1的缺失可以消除oxLDL引起的巨噬细胞中黏着斑的持续激活，降低oxLDL诱导的活性氧产生，抑制oxLDL引起的巨噬细胞肌动蛋白的聚合和细胞硬度的增加。当我们在Tmod1敲除的巨噬细胞中重新表达Tmod1时，oxLDL引起的巨噬细胞胆固醇聚集和迁移抑制可重新被观察到。在巨噬细胞中过表达Tmod1可促进巨噬细胞在硬基质上的黏附和伸展，还促进巨噬细胞中actin的聚合。从分子机制上看，Tmod1是通过调节清道夫受体CD36的表达和整合素下游信号通路的激活而影响oxLDL和基质硬度对巨噬细胞的作用的。这是由于Tmod1的过表达或敲除可引起巨噬细胞中CD36表达的上调或降低。在Tmod1敲除的巨噬细胞中重新表达CD36，能够恢复oxLDL引起的巨噬细胞胆固醇聚集和迁移抑制；而Tmod1过表达可以增加高基质硬度诱导的巨噬细胞中整合素下游信号通路中FAK和paxillin的激活水平，同时促进黏着斑蛋白vinculin的表达。我们的研究表明，巨噬细胞中的Tmod1在oxLDL和高基质硬度诱导的动脉粥样硬化斑块的发生发展中起着至关重要的作用，这为我们提供了一个预防和治疗动脉粥样硬化的潜在靶点。同时我们的结果还提示，在临床中防治和干预动脉粥样硬化应以软化血管、降低血管基质硬度为首要目标。