离子交换柱原位PEG修饰蛋白药物的微环境工程研究

为解决传统聚乙二醇（PEG）液相修饰存在的修饰选择性差，后期分离纯化步骤多，难以得到均一产物等弊病，以水蛭素作为模型蛋白药物，用离子交换柱原位PEG修饰与产物分离集成化技术来实现高效、定点修饰与分离。针对目前色谱柱原位修饰存在的修饰率偏低的技术难题以及传统水相环境中活化PEG修饰剂易于水解的缺点，开展微环境工程研究，从蛋白吸附、修饰反应、分离三个方面系统研究原位修饰过程。研究内容包括：以转化率为指标，重点考察离子交换介质的粒径、孔径以及配基种类与密度对PEG修饰的影响，确定最优的离子交换固相介质；系统考察影响修饰与分离的微环境因素，如pH、离子强度、温度、亲疏水性等，确定并优化其中的关键因素，建立适合原位PEG修饰的微水环境；采用分子模拟结合相关实验技术研究蛋白在固相表面的吸附取向和构象变化，确定准确的修饰位点，弄清原位PEG修饰的机理。

传统液相PEG修饰存在修饰位点选择性差以及传统水相环境中PEG修饰剂易于水解的缺点。本项目以水蛭素作为模型蛋白药物，系统研究了各种微环境因素对PEG修饰反应和分离过程中的影响（统称为微环境工程）。基于基元反应理论建立了PEG修饰水蛭素的动力学模型，该模型不仅为真实的PEG修饰过程提供一个可能的机理解释，而且能很好地被用于整个PEG修饰步骤的优化控制。建立了高效的非水相PEG修饰反应体系，PEG修饰速率能显著加快，提高了微酸性条件下定点修饰水蛭素组氨酸残基的效率，减少了PEG修饰剂的用量，降低了原料成本。采用离子交换柱原位PEG修饰技术实现了反应和分离过程的集成，确定了影响原位修饰率低的关键因素为孔径扩散。采用大分子分枝型mPEG2-NHS修饰剂获得了高得率的单修饰产物，其在家兔体内的药代动力学性能更具优势。采用mPEG-ALD定点修饰水蛭素的N末端，提出了响应面分析结合反应动力学的过程优化方法，获得了高得率、高特异性的单修饰产物。本项目研究充分利用了蛋白质的结构和活性的关系，通过优化PEG修饰的微环境工程，有效控制了PEG修饰的位点，为高效开发PEG修饰蛋白质药物提供了新的思路。