磷酸化和乙酰化修饰对微管结构特性和胞内运输功能的调节

The post-translational modifications (PTMs) of tubulin, or tubulin PTM codes, are highly related to structural properties of microtubules and essential roles in the cellular functions of microtubules. The proteomic landscape of tubuiln PTM codes, however, is far from complete and accurate, with deficient knowledge about their spacial and temporal distribution as well as functional roles. In our preliminary study, we established a proteomic workflow to identify tubulin PTM codes that have been less characterized before. In addition, we explored the roles of site-specific modifications in mediating microtubuledynamics and cellular function. The current project is aimed at systematic identification of phosphorylation and acetylation of tubulin and study of their roles in mediating the structural properties and cellular transport function of microtubules. Following the in-depth proteomic analysis, we will construct a panel of modification-mimic or modification-deficient mutants of tubulin at specific sites. These mutants will be subjected to in vitro and in vivo functional assays to determine the roles of certain PTM codes in regulating microtubule stability, dynamics and microtubule-dependent intracellular transport.

微管蛋白的翻译后修饰（修饰密码）与微管的结构特征密切相关，对微管参与的多种细胞活动发挥着关键作用。然而，已有研究中对微管蛋白修饰密码鉴定的覆盖面、深度和准确性都较有限，并且对不同种微管蛋白修饰密码的功能性研究也有待拓展和深入。前期研究中我们建立了微管纯化和质谱分析技术用以解析以往表征不足的微管蛋白修饰密码，并初步探索了特定位点的修饰如何调节微管的结构特性和细胞功能。在此基础上，本课题锁定磷酸化和乙酰化这两种广泛调节蛋白质活性与功能的翻译后修饰类型，全面解析它们在微管蛋白上的定位，并模拟空间分布；而后构建特定的磷酸化或乙酰化位点的模拟修饰和缺失修饰的微管蛋白突变体，通过研究突变体在特定胞内功能实验中的表型，系统地考察位点特异的磷酸化或乙酰化修饰对微管的稳定性、再生效率以及微管介导的胞内运输过程的调控作用。

微管蛋白的翻译后修饰（修饰密码）与微管的结构特征密切相关，对微管参与的多种细胞活动发挥着关键作用。然而，已有研究中对微管蛋白修饰密码鉴定的覆盖面、深度和准确性都较有限，并且对不同种微管蛋白修饰密码的功能性研究也有待拓展和深入。本项目按预期计划首先完成了对微管蛋白多种修饰密码的系统性解析，全面鉴定了微管蛋白上存在的总共80种修饰位点，修饰类型包括磷酸化、乙酰化、泛素化和O-型乙酰葡糖胺糖基化修饰。其中有24个修饰位点在之前的组学研究和数据库中未被报道。这部分工作显著提高了微管蛋白修饰密码解析的覆盖面和准确度。..在此基础上，本项目进而详细研究了特定位点的修饰密码对细胞内微管的组装、稳定性和再生活性的调节作用，而后以腺病毒运输为模型考察特定修饰密码对微管依赖的病毒反向运输的调控。实验结果表明，特定的修饰密码对微管蛋白的特性与功能起到了不同程度的调节作用。例如，含K40Q突变的微管相对于K40R突变体更稳定，这与已报道的该位点乙酰化修饰大量存在于稳定微管部分是一致的。然而，K96/112Q突变体的稳定性与K96/112R相比则是降低的，说明乙酰化修饰与微管结构稳定性的正相关关系是位点特异的。值得注意的是，含磷酸化修饰的微管展现出了较低的稳定性并且再生活性下降。另外，以腺病毒运输为模型，我们发现含有K326 and K96/112位点上乙酰化修饰的微管其病毒反向运输速率低于K40乙酰化的微管。模拟磷酸化缺失的T257A突变体与野生型相比，既降低了微管的组装效率也影响了微管的胞内运输功能。..最后，在整合多个层面实验数据的基础上，我们从蛋白质结构的角度初步讨论了微管蛋白的磷酸化和乙酰化修饰调节微管结构特性和胞内运输功能的可能的分子机制。..在本项目的支持下共发表SCI论文8篇，发表于Journal of Proteome Research, Scientific Reports和Protein & Cell等国际期刊，培养了1名博士生和2名硕士生。