基于BRD4和HDAC3协同调控乙酰化探讨脑胶质瘤细胞分化的表观遗传学机制

Epigenetic regulation can dominate glioma cells in tumor and non-tumorigenic state between dynamic and reversible transformation. Looking for glioma epigenetics key points, the use of epigenetic mechanisms to intervene, is expected to have cancer treatment effect. Previously, we used a customized shRNA library to perform a one-by-one primary screening. During the screening, we found that knockdown of Brd4 or Hdac3 by shRNAs suppressed self-renewal and induced apoptosis and differentiation of glioma initiating cells, indicating that Brd4 or Hdac3 is a potential glioma drug target. In this project, we proposed the CRISPR - Cas9 mediated Brd4 or Hdac3 specific gene silence or using Brd4 / Hdac3 selective inhibitors to suppress self-renewal and induced apoptosis and differentiation of glioma initiating cells, then we will perform RNA-seq and CHIP-seq to understand the epigenetics molecular mechanism of combination inhibition of Hdac3 with Brd4 as potential therapies for glioma. This project will provide theoretical basis and experimental basis for the invention of novel therapeutics informed by an enhanced understanding of its molecular pathogenesis.

表观遗传学调节可以支配脑胶质瘤细胞在致瘤和非致瘤状态之间动态和可逆性转变。由于脑胶质瘤的异质性，探寻脑胶质瘤表观遗传学关键位点，利用表观遗传学机制进行干预，日益受到关注。我们在前期工作中，利用shRNA表观遗传学文库筛查发现下调溴结构域蛋白4（Brd4）和组蛋白去乙酰化酶3（Hdac3）基因表达，能明显抑制小鼠脑胶质瘤始动细胞增殖和自我更新，促进其凋亡和分化，故推测二者可能成为恶性脑胶质瘤潜在的治疗靶点。在本项目中，我们拟应用CRISPR-Cas9基因编辑技术特异性敲除BRD4或HDAC3基因及BRD4/HDAC3特异性抑制剂，验证对脑胶质瘤始动细胞增殖、自我更新、凋亡及分化的影响；应用ChIP-Seq及RNA-seq等技术，揭示BRD4和HDAC3协同调控乙酰化交互作用在脑胶质瘤细胞分化的表观遗传学机制，为探寻脑胶质瘤表观遗传学新靶点、新机制，提供理论依据与实验基础。

表观遗传学调节可以支配脑胶质瘤细胞在致瘤和非致瘤状态之间动态和可逆性转变。由于脑胶质瘤的异质性，探寻脑胶质瘤表观遗传学关键位点，利用表观遗传学机制进行干预，日益受到关注。在本项目中，我们确定筛选出的BRD4 或HDAC3 是恶性脑胶质瘤潜在的治疗靶点，体外实验：CCK8检测结果显示，JQ1联合RGFP966组对GSCs细胞活力的抑制作用明显，且呈现出显著的协同效应；细胞生长计数结果表明，JQ1或siBRD4联合RGFP966组的细胞显著受到抑制，数量最少；克隆形成实验证实，JQ1和RGFP966组所形成的克隆数量最少；神经球成球实验结果显示，JQ1或siBRD4联合RGFP966组的细胞自我更新的能力最差；流式细胞术结果表明，JQ1或siBRD4联合RGFP966组发生凋亡的细胞数量最多，且绝大部分细胞发生G1期的细胞阻滞；TUNEL染色结果表明，JQ1联合RGFP966组出现绿色荧光的细胞数量最多，且荧光强度较强。体内实验：JQ1联合RGFP966组的小鼠肿瘤体积最小，免疫组织化学染色观察发现，JQ1联合RGFP966组细胞增殖和分化的标记物变化最显著；TUNEL染色检测结果显示，JQ1联合RGFP966组的细胞凋亡显著增加。为探讨了BRD4 和HDAC3 调控乙酰化途径交互作用对恶性脑胶质瘤的分化的表观遗传学作用机制，采用RNA-seq测序技术推测GLI1是JQ1联合RGFP966抑制脑胶质瘤生长过程中的关键分子；Western-blot证实联合抑制BRD4和HDAC3能显著抑制GLI1的表达，而GLI1下调能抑制STAT3信号通路，siGLI1联合RGFP966能显著抑制STAT3信号通路以及Bcl-2和Mcl-1的表达；ChIP结果表明RGFP966能增强GLI1基因在H3K27位点的乙酰化水平并在其启动子处募集更多BRD4来参与其转录；ELISA结果表明GLI1受到抑制后能减少IL-6的分泌；ChIP结果表明GLI1能直接调控IL-6的转录；Western-blot结果表明siIL-6能抑制STAT3通路的激活，而这种抑制作用又同时能被外源性的IL-6恢复。为深入探讨脑胶质瘤的发病机制和开发基于表观遗传学的脑胶质瘤的新靶点、新疗法提供了理论基础和实验依据。