荧光假单胞杆菌中的抗生素DAPG合成酶的晶体结构及其催化机理

Pseudomonas fluorescens which colonize in the roots of plants produce a wide variety of secondary metabolites that can effectively prevent the roots being infected by the pathogenic microorganisms. It is therefore a widely used biocontrol agent in agricultural production. The compound 2,4-diacetylphloroglucinol (DAPG) is one of the metabolites produced by pseudomonas fluorescens and displays a remarkably broad spectrum of toxic activity toward bacteria,fungi and even nematodes. Although the DAPG biosynthetic gene cluster has been biochemically characterized, the three dimensional structures and catalytic mechanisms of these key enzymes involved in this process is still unknown. In this proposed project, we plan to solve the crystal structures of the key enzymes involved in the DAPG synthesis, namely PhlD, PhlACB complex and PhlI. Structural analysis in combination with the mutagenesis and enzymatic assay can provide us the detailed catalytic mechanisms of these key enzymes. We also attempt to reconstitute the DAPG biosynthesis in solution in order to identify all the key steps in this process. These studies can not only strengthen our understanding of the key steps and catalytic mechanisms of the DAPG biosynthesis, but pave the road for the improvement for the activity of the enzymes involved in the synthesis as well.

荧光假单胞杆菌存在于植物根部，可以产生一系列次生代谢产物，抑制病原微生物对植物根部的侵染，具有良好的生物防治活性，在农业生产上有着非常广泛的应用。2,4-二乙酰基间苯酚（DAPG），是由荧光假单胞杆菌合成的一种具有光谱抗菌活性的抗生素类活性的化合物。参与DAPG生物合成的一些关键基因虽然已经得到生化上的鉴定，但是对于它们的三维结构和催化反应机理目前还并不清楚。本项目计划解析DAPG生物合成的关键酶PhlD，PhlACB及PhlI的晶体结构，并通过定点突变和酶活分析，阐明这些关键酶的催化反应机制。此外，我们还计划利用纯化的蛋白，在溶液中重构DAPG的合成，从而鉴定出DAPG完整的生物合成的过程。这些研究，不但可以加深我们对DAPG生物合成过程和机理的认识，同时也为DAPG合成的酶学改良提供了理论基础。

在植物根际的土壤中，存在着一些荧光假单胞菌产生2，4-二乙酰基间苯三酚（2,4-DAPG）来拮抗其他植物病原，包括细菌、真菌、卵菌及线虫等。由于2,4-DAPG对荧光假单胞在根际的竞争性定殖非常重要，因此存在多个层面上对其的生物学合成的调控。在本研究中，我们重点研究了与2,4-DAPG的代谢相关的蛋白的结构与功能。我们首先研究了参与2,4-DAPG生物合成的重要复合体PhlACB，通过在大肠杆菌中超表达PhlACB，能够高效的将前体分子PG转化为2,4-DAPG，同时我们通过定点突变发现PhlA的S89和S90以及PhlC的C88是该复合体的活性中心。我们还鉴定了环境中的一种MAPG水解酶MaPhlG，并解析了其晶体结构，揭示了其催化MAPG水解的重要的活性位点。另外，我们发现在2,4-DAPG代谢相关的基因簇Phl中的转录因子PhlH可以作为阻遏物结合在PhlG上游30bp的DNA序列。通过生化手段的筛选，我们鉴定出2,4-DAPG可以对PhlH去阻遏。通过对PhlH缺失株以及PhlHPhlG双缺失株的2,4-DAPG合成的检测我们进一步确定了这两个基因对2,4-DAPG的生物合成构成了一个负反馈调控回路。同时我们发现PhlG并不参与对2,4-DAPG的耐受性，而是减轻了荧光假单胞菌在碳源或氮源缺乏条件下的代谢负担，这就暗示了PhlG和PhlH在进化过程中的获得提高了荧光假单胞菌在根际的竞争环境下的适应度。