荧光假单胞菌FD6中Vfr调控抗生素2,4-DAPG合成机制研究

Pseudomonas fluorescens FD6 protects various plants against plant fungi through antibiotics 2,4-diacetylphloroglucinol (2,4-DAPG), pyoluteorin (PLT) and pyrrolnitrin (PRN). Sensor kinase GacS, RetS and cyclic-AMP binding protein orthologue Vfr could regulate the biosynthesis of antibiotics 2,4-DAPG, PLT and PRN. Our previous study showed that Vfr had negative effect on the biosynthesis of these three antibiotics, whereas the regulatory mechanism is still unknown. In this proposal, the possible Vfr binding domain will be obtained by bioinformatics analysis, and the Vfr-target involved the biosynthesis of 2,4-DAPG will be identified by electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and site-directed mutagenesis. The corresponding genes will be further mutated and complemented, and the effects on 2,4-DAPG production will be confirmed by HPLC. We will reveal the mechanism of Vfr as a novel regulatory element in the complex network controlling the expression of 2,4-DAPG in Pseudomonas genus. Our findings of this project will illustrate function of Vfr for biocontrol ability in biocontrol agents, and provide a supplement to the study on regulation of antibiotic biosynthesis of pseudomonads. It will also provide important reference data for future study on microbial fermentation, medical bacterial diseases and genetic modification of biological control agents.

荧光假单胞菌FD6主要通过产生2,4-二乙酰基间苯三酚（2,4-diacetylphloroglucinol，2,4-DAPG）等多种次生代谢产物防治植物真菌病害，且抗生素合成受到感应激酶GacS、RetS和cAMP受体蛋白同源物Vfr的调控。前期研究发现vfr对2,4-DAPG合成有负调控作用，但调控机制还不清晰。本项目拟采用生物信息学分析Vfr可能的作用靶标，通过Vfr结合域定点突变及凝胶迁移电泳（EMSA）获得影响2,4-DAPG产生的靶标蛋白，构建相应的Vfr靶标基因的内缺失突变体、互补恢复突变，检测其对抗生素2,4-DAPG合成的影响，解析Vfr间接调控抗生素2,4-DAPG合成的途径。对以上问题的研究，不仅可明确Vfr在生防菌生防功能中的作用，对假单胞菌抗生素合成调控研究是个补充，其结果还可为生防菌遗传改良提供重要理论依据，在工业微生物发酵和医学细菌病害的研究上也有指导作用。

Pseudomonas protegens FD6中转录因子Vfr负调控抗生素藤黄绿脓菌素（PLT），2,4-二乙酰基间苯三酚（2,4-DAPG）和硝吡咯菌素（PRN）的合成，并在转录水平影响pltA，phlA和prnA基因的表达，但Vfr调控抗生素合成的具体机制尚不清楚。本项目以2,4-DAPG为靶标，深入系统揭示Vfr如何与2,4-DAPG合成基因簇发生互作，取得了以下研究进展：（1）明确了抗生素2,4-二乙酰基间苯三酚和藤黄绿农菌素是生防假单胞菌FD6主要防病因子，且二者存在交互调控；（2）通过全基因组分析，预测到FD6可产生11种次生代谢产物，包括2,4-DAPG、PLT、氢氰酸、PRN、orfamideA、嗜铁素及3种未知化合物；（3）利用ChIP-seq技术手段富集并筛选到与Vfr结合的靶基因序列90个，根据其基因功能可划分为17类，包括次生代谢、转录因子、双组分系统、戊糖磷酸途径、生物膜形成、细菌趋化性、运动性和分泌系统等；（4）实时定量qRT-PCR检测这90个基因的表达，明确了7个基因的转录水平升高（>2倍），21个基因的转录水平降低（>2倍），其中，vfr基因自身转录水平降低5.5倍。并且推定了Vfr一致结合基序[A/G]TCACA[T/G/C][G/A/C/T]；（5）采用原核表达系统表达了Vfr蛋白，其中一部分是可溶性蛋白，一部分以包涵体的形式存在，分子量大小约为25kDa，蛋白的诱导条件为IPTG终浓度0.5mM，20℃诱导8h；（6）通过细菌单杂交和EMSA证实转录调控因子Vfr可以进行自体调控，通过直接作用于phlF和phlG影响2,4-DAPG合成，为生防细菌的遗传改良提供新途径。