斑茅关键木质素合成酶基因克隆、RNA干扰及抗逆性表达研究

Saccharum arundinaceus is one of the native cellulosic biofuel plants, which possess many excellent characteristics such as high yield, good barren tolerance and strong resistance, and there are abundant natural resources in tropical and subtropical regions in China. Lignin content is the important factor that affects the rate of energy conversion, therefor, it is the main index of energy grass breeding, but it's difficult to breed low lignin content of S. arundinaceus by traditional means. This study is designed based on previous research, we will clone the key enzyme genes of lignin synthesis in S. arundinaceus , and analyse their functions; inhibit the expression of these key enzyme genes for creating S. arundinaceus of low lignin content through RNAi technology. On the other hand, the study will evaluate the potential risk of reduced stress resistance in transgenic plants through physiology indexes study. By means of the different expression of antioxidant enzyme gene in adversity stress, this study try to explore the molecular mechanism of stress reactions affected by the inhibited expression of the key enzyme genes, then provide a reference for the rational use of RNAi technology in S. arundinaceus breeding.

斑茅是一种高大、耐瘠薄、抗逆性强的本土纤维素类能源植物，广布于我国热带、亚热带地区。木质素含量是影响能量转化率的重要因素，是能源草选育的主要性状指标，通过传统的研究手段获得低木质素材料困难大、周期长。本项目拟在现有研究基础之上,克隆斑茅关键木质素合成酶基因，并对其进行功能分析;同时利用RNAi技术抑制木质素合成关键酶的表达,进而创制低木质素斑茅材料；并通过对新材料抗逆性生理指标观测,评价木质素含量降低造成斑茅抗逆性减弱可能存在的潜在风险;通过在逆境胁迫下抗氧化酶基因的差异表达研究探索木质素合成关键酶基因受抑制对斑茅抗逆反应影响的分子机理, 为RNAi技术在斑茅育种中的合理利用提供参考。

斑茅是一种高大、耐瘠薄、抗逆性强的本土纤维素类能源植物，广布于我国热带、亚热带地区。木质素含量是影响纤维素类能源植物能量转化率的重要因素，是能源草选育的主要性状指标，通过传统的研究手段获得低木质素材料困难大、周期长。本项目克隆斑茅关键木质素合成酶基因，同时利用RNAi技术抑制木质素合成关键酶的表达， 为低木质素斑茅育种提供参考，开展斑茅叶片光合器官建成过程中光合能力及光抑制的变化研究，为斑茅的能源转化利用提供依据，获得以下重要结果：.（1）成功克隆斑茅关键木质素合成酶基因COMT、4CL、CCR基因，并利用RACE技术获得这三个基因的全序列，COMT基因全长为1480bp，其ORF长度为1080bp，4CL基因全长为2048bp，其ORF长度为1659bp，CCR基因全长为1602 bp，其ORF长度为1110bp；通过与NCBI基因库中COMT、4CL和CCR基因数据比较，发现相似性在95%以上，斑茅的COMT、4CL、CCR基因与甘蔗、高粱和玉米的COMT、4CL、CCR基因同源性高，进化树分析得到斑茅的这三个基因与单子叶植物的进化程度一致，其中与近缘种甘蔗的进化程度最近，说明了克隆出的COMT、4CL、CCR基因是目标基因。（2）利用130035SI-X载体，采用酶切法，构建了三个基因的RNAi载体，并完成了在拟南芥中的遗传转化验证，成功获得转基因植株，为RNAi技术在低木质素斑茅育种中的应用提供了重要参考。（3）以种子为外植体，成功构建了斑茅高频再生体系，愈伤诱导率、芽分化率、根分化率分别为100%、71.11%和96.97%，为斑茅的遗传转化和转基因研究奠定了重要基础。（4）开展了斑茅叶片光合器官建成过程中光合能力及光抑制的变化研究，发现幼叶及老叶的叶绿素和类胡萝卜素含量均显著低于成熟叶，光合生产力和光能利用率均显著低于成熟叶，气孔密度：成熟叶＞幼叶＞老叶，净光合速率：成熟叶＞幼叶＞老叶，实际光化学量子产量（YIELD）：成熟叶＞幼叶＞老叶，为斑茅的能源转化利用提供依据。