灯盏花主要药效成分灯盏乙素的微生物合成研究

Erigeron breviscapus (Vant.) Hand.-Mazz. is one of medicinal plants with regional feature of Yunnan Province, which particularly and highly accumulates scutellarin, a kind of 6-OH flavone glucuronide derivatives, the biosynthesis mechanism of scutellarin is still unclear. Our group had found the candidate genes which might encode flavone 6-hydroxylase (F6H) and flavonoid 7-O- glucuronosyltransferase (F7GAT), respectively, and involved in the last two key reactions, hydrolation at 6-C and glucuronidation at 7-C of scutellarin. In this study, we will transform all the genes of the whole biosynthetic pathway of scutellarin into engineered yeast and optimizing the system to lay the foundation of industrial production of scutellarin. This project will contribute to the transition from traditional plants to high-efficiency fermenting industry.

灯盏花[Erigeron breviscapus (Vant.) Hand.-Mazz.]是最具云南地方特色药用植物之一，能够特异性地积累高含量的灯盏乙素(6-OH黄酮的葡糖苷酸) ，其生物合成最后两步反应机理尚未完全明确。基于基因组和转录组测序，项目组已经获得了催化灯盏乙素生物合成最后两步关键反应酶（F6H和F7GAT）的候选基因序列，并将很快鉴定出其功能。本项目拟将灯盏乙素途径的所有基因整合入酿酒酵母中，在酵母工程菌中重构完整的灯盏乙素合成途径并优化酵母工程菌，建立灯盏乙素工业发酵平台，实现灯盏花由传统种植业向现代发酵工业跨越。

灯盏乙素是云南药用植物灯盏花[Erigeron breviscapus (Vant.) Hand.-Mazz.]的重要活性成分。本项目拟将灯盏乙素途径的所有基因整合入酿酒酵母中，在酵母工程菌中重构完整的灯盏乙素合成途径并优化酵母工程菌，建立灯盏乙素工业发酵平台。我们通过删除胞质苹果酸合酶基因（MLS1）和酵母菌株中的过氧化物酶体柠檬酸合酶基因（CIT2），阻止乙酰-CoA的氧化消耗，提高了灯盏乙素产量达到14.3 mg/g；我们设计了一个产生丙二酰-CoA的多基因模块，将内源性醛脱氢酶基因（ALD6），ACS SE L641P和内源性乙醇脱氢酶基因（ADH2）基因整合到了双敲除菌株的YPRCΔ15基因座中，获得了一株工程酵母菌株，与初始菌株相比，其灯盏乙素产量提高了1.68倍。当我们在发酵过程中优化DOC时，灯盏乙素和芹菜素-7-O-葡糖醛酸苷（灯盏甲素）的最大产量分别达到108和185mg/L。.通过三代PacBio数据和Hi-C数据更新了灯盏花基因组，获得一个基因组大小为1.43 Gb，scaffold N50达到156.82 Mb，contig N50达到140.95 kb的高质量组装版本，并锚定到9条假染色体；完整度达88.5%，灯盏花基因组成为菊科中组装最好的基因组之一，继向日葵（Helianthus annuus）以后第二个组装到染色体水平的基因组。从新版基因组中找到3个可能参与灯盏乙素合成最后一步的F7GAT候选基因，发现了一个酰基转移酶HCT4可以催化咖啡酰辅酶A与奎宁酸形成绿原酸，首次在灯盏花中解析绿原酸生物合成途径。灯盏花中超表达PAL，C4H，4CL，CHS，CHI，FSⅡ可显著增加灯盏乙素含量（1.92到3.42倍）。