最适代谢流/发酵还原力配比条件下的高效丁醇萃取发酵的机制和应用研究

在理论层面上，对选择性丁醇萃取发酵和添加电子载体强化还原力的发酵体系进行耦联，充分发挥选择性萃取发酵和强化还原力体系之所长：利用萃取发酵促进丁醇发酵整体代谢，通过强化还原力促进丁醇的高效生成、同时抑制副产物丙酮的积累。在实用层面上，以生物柴油作为丁醇发酵的萃取剂，可以提高"改良型"生物柴油的质量和产量；将萃取有丁醇的萃取剂直接作为改良型生物柴油使用，生物柴油的诸多缺点有望得到改善，同时还完全省去了耗能的发酵产品精馏回收过程；对选择性丁醇萃取发酵和添加电子载体强化还原力的发酵体系进行有效耦联，有望提高"丁醇实质性得率"，降低发酵残液中发酵产物的浓度、提高萃余液的回用能力。实现提高生产强度、改善产品质量、节能节水和降低环境污染的四者的有机统一，符合国家所着力倡导的"节能减排"工业生产模式，对现有生物柴油工业的技术改造具有指导和参考价值。

本项目以匹配发酵代谢流与还原力（电子流）、提高丁醇得率和丁醇/丙酮比和全面回用发酵废水、节能式生产多样化的丁醇产品为主线，使用一株丙酮丁醇梭状芽孢杆菌Clostridium acetobutylicum ATCC 824，开展高效丁醇发酵的应用和理论研究。首先，提出了节水节能式丁醇萃取发酵联产“改良型生物柴油”和燃料添加剂产品的新型发酵工艺。以玉米粉为原料，在7 L静态厌氧罐、生物柴油/发酵液体积比1:1的萃取发酵条件下，生物柴油中的丁醇浓度达到10 g/L以上；萃余液中60%以上的丁醇可用少量辛醇进行浓缩回收；萃余液再经少量活性炭吸附处理后、可100%用于次轮发酵的配料，萃余液反复全回用14次以上且发酵性能稳定。上述工艺确保了“改良型生物柴油”的质量、大幅提高了“目标丁醇得率”、降低了丁醇产品的精制能耗、实现了发酵废水的零排放和发酵产品的多样化、促进了“吃干榨尽”的理想工业生产模式的推广。其次，利用还原力较强的“非粮”发酵原料-木薯粉替代玉米粉进行丁醇发酵，对其发酵特征和最优发酵工艺进行了理论分析。研究发现：木薯原料发酵中，产酸相向溶剂生产相的转型严重迟延或无法进行；当发酵产气停止后适时添加浓缩酵母浸粉液（2.5 g-酵母浸粉/L-broth），产气迅速回升、CoA-transferase（辅酶A转移酶）被激活、其编码基因ctfAB的转录水平大幅提升15倍以上，有利于丁醇合成的天冬氨酸族氨基酸大量分泌，丁醇生产强度与使用玉米原料时的水平基本持平或更高；丁醇/丙酮比从2.0:1提高到2.5-3.0:1左右，产品品质提高、原料成本大幅下降。最后，在使用木薯和玉米原料的条件下，利用梅森定理将碳代谢网络转化成有向信号线图并结合使用含有电子穿梭传递系统的NADH再生模型，对碳代谢和还原力再生（电子流）的最适匹配关系进行了分析计算并对主要代谢路径中的关键酶基因转录水平/中间产物进行了测定。结果表明，木薯原料发酵下的丁酸生成/吸收再利用闭环的代谢强度低、但NADH再生速度高，两者共同作用实现了代谢流/发酵还原力的最适配比、最终导致丁醇/丙酮比大幅提高。但是，木薯原料油醇萃取发酵时的丁醇/丙酮比已经达到理论极限，适时添加微量电子载体-中性红无法继续增大丁醇/丙酮比。以上结果是利用强还原力发酵原料，有效匹配代谢流和还原力的平衡、提高丁醇/丙酮比的第1份综合研究报告。