缓释BMP-2和VEGF的HAp纳米仿生再生丝蛋白涂层在PET韧带材料中的应用性基础研究

The graft selection in anterior cruciate ligament reconstruction is great challenge for sports medicine research. Poly (ethylene terephthalate) (PET) artificial ligaments are considered a promosing biomaterials for anterior cruciate ligament. However, the further application of PET artificial ligaments was limited by its disadvantages such as poor tendon-bone biological healing, complicated synovitis and unfirm interference fixation. Our previous studies have proved that restructure silk fibroin (RSF) layer coating on the surface of PET artificial ligament can improve the biocompatibility of PET artificial ligament, while hydroxyapatite (HAp) nanoparticles growing on the surface of PET artificial ligament by biomimeralization can promote the tendon-bone healing. Furthermore, our previous research also showed that human bone morphogenetic 2 (BMP-2) and human vascular endothelial growth factor (VEGF) could enhance bone regeneration, and RSF was good veil to control release drug. Here, this project is aim to firstly design a novel HAp-RSF layer which can control release both BMP-2 and VEGF by mixing nanotechnology, biomimetic and molecular biological methods, and then further evaluate the feasibility of its application in anterior cruciate ligament by a series experiements in vitro and vivo. Our research will provide theoretical and experimental foundation for the final clinical practice of the new suspended-fixed biological PET artificial ligament with independent intellectual property rights.

对于前交叉韧带损伤重建手术，目前多项临床研究证明聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)人工韧带的中短期疗效及安全性较为满意，但其仍存在腱骨愈合不佳和并发滑膜炎等问题。我们前期研究应用生物矿化的方法经再生丝蛋白(RSF)诱导在PET材料表面形成纳米级羟基磷灰石(HAp)涂层.，且体内外实验证实该涂层具有良好的生物相容性和促腱骨愈合特性。此外，前期研究证明骨形态发生蛋白(BMP-2)和血管内皮生长因子(VEGF)可协同作用促成骨分化，同时RSF可作为良好的药物缓释载体。本课题拟通过整合仿生矿化、纳米技术和生长因子缓释技术，在PET材料表面制备一种具有缓释BMP-2和VEGF的HAp纳米仿生RSF涂层，并通过体外细胞相容性、体内动物实验、生物力学检测等方法，综合评价其生物相容性和体内促腱骨愈合等性能。本课题将前沿技术和临床需求有机结合，有望获得具有自主知识产权并能临床应用的研究成果。

人工韧带进行前交叉韧带重建术后会出现骨道扩大、瘢痕愈合的问题，改善人工韧带材料的疏水性、增强骨诱导性和骨传导性，是解决这些问题的关键。本研究利用丝蛋白进行生物矿化、负载生长因子对人工韧带材料进行涂层处理以促进移植物—骨界面的愈合。研究内容以及发现主要有以下三个方面：1.通过EDC/NHS交联法在PET材料表面制备丝蛋白涂层。热重分析发显示通过EDC/NHS交联法进行涂层后的材料表面的丝蛋白的量高于浸泡涂层法。细胞培养后7天可观察到实验组表面细胞伪足形成，而未涂层组细胞仍成圆形或椭圆形。实验组中细胞的增殖水平和BMP2、OCN、CollagenI在RNA水平和蛋白水平的表达量均高于对照组。动物实验的组织学分析显示丝蛋白涂层组移植物-骨间的界面距离较小，组织愈合较好。以上结果表明经过EDC/NHS交联法得到的丝蛋白涂层可有效促进PET-骨组织的愈合，有利于ACL重建术后的康复。2.利用负载VEGF的丝蛋白对超高分子聚乙烯纤维进行涂层，VEGF缓释可持续至28天，兔前交叉韧带重建模型，术后6周和12周取材，组织切片发现负载VEGF的丝蛋白涂层可促进界面的血管新生，且界面形成的胶原排列更加有序，最大拉力和刚度也高于单纯丝蛋白涂层组和空白对照组。3.利用仿生矿化的方式，将丝蛋白涂层与HAp沉积相结合，对人工韧带进行涂层，通过扫描电镜、原子力显微镜、红外光谱对制备的涂层进行表征，证实涂层的存在并且观察到涂层使材料表面的粗糙程度增加。利用比格犬前交叉韧带重建模型，术后4周和8周取材进行组织学分析。观察到术后8周PET+丝蛋白/HAp组移植物骨界面组织更为成熟，移植物骨界面相对于PET组宽度明显缩小，且有新骨生成。力学实验发现术后8周PET+丝蛋白/HAp组的最大失败载荷及刚度值均大于对照组。本研究证实了通过丝蛋白进行仿生矿化和负载生长因子的涂层方式，对人工韧带材料进行改性，可以有效改善材料的生物相容性，促进材料在体内的移植物—骨愈合效果。