抗性CYP6G4基因过量表达的分子机制研究

Cytochrome P450s play a pivotal role in insecticide detoxification in insects. Increased detoxification of insecticides by cytochrome P450s has been long proved to be a very important mechanism for almost all types of insecticide, characterized by either increased enzyme production or a change in P450 enzyme itself. Until recently, the precise mechanisms leading to upregulation of insecticide-associated P450 genes have not been fully characterized in most cases at the molecular level. In this project, we attempts to investigate the molecular basis for the upregulation of the CYP6G4 gene in pyrethroid resistant house flies. To achieve aforementioned goals, we will identify important regulatory DNA sequence(s) affecting expression of CYP6G4 gene by luciferase reporter assays of progressive deletion and site-directed mutation constructs, followed by characterization of key regulatory molecule(s) that interacts with the regulatory DNA sequence of CYP6G4 in pyrethroid resistant house flies by a combination of electrophoretic mobility shift assays (EMSA), co-expression luciferase reporter assays and RNA interference analyses. The findings anticipated from this project will enrich our understandings of molecular basis of P450-mediated insecticide resistance at the regulation level in a context of evolution and will be helpful for effective monitoring and management of insecticide resistance by providing novel genetic marks for resistance detection and potential targets for the development of novel control agents.

昆虫抗药性作为人为干扰下的微进化现象，不仅成为害虫防治工作的一个现实问题，也是进化生物学的一个重要科学问题。细胞色素P450（简称P450）过量表达而增强其对杀虫剂的代谢解毒作用是昆虫产生抗药性的普遍而重要的机制。由于P450种类和功能多样性、调控机制的复杂性，至今我们对P450介导抗药性的分子机制的认知严重缺乏。本项目拟以家蝇拟除虫菊酯杀虫剂抗性 CYP6G4为研究系统，运用昆虫毒理学、生物化学和分子生物学的研究手段，通过启动子转录活性分析和调控因子鉴定，明确调控CYP6G4基因表达的重要顺式作用元件以及与之相互作用的关键调控因子，剖析抗性CYP6G4基因过量表达的分子机制。预期研究结果在科学上可以增强人们对昆虫P450表达调控分子生物学和生物适应（抗药性）进化机理的认识，在实践上可以为害虫抗药性的诊断与预警提供分子标记、为害虫控制剂的研制发现新靶点或提供新思路。

昆虫抗药性不仅是害虫防治工作面临的一个现实问题，也是进化生物学的一个重要科学问题。细胞色素P450过量表达而增强其对杀虫剂的代谢解毒作用是昆虫产生抗药性的普遍而重要的机制。由于P450种类和功能多样性、调控机制的复杂性，至今我们对P450介导抗药性的分子机制的认知严重缺乏。.项目以家蝇拟除虫菊酯杀虫剂抗性相关的 CYP6G4基因为研究对象，运用昆虫毒理学、遗传学、生物化学和分子生物学的研究技术手段，主要开展了：1）CYP6G4 基因序列的多态性与分子进化分析；2）CYP6G4基因转录顺式调控元件的鉴定；3）CYP6G4转录调控因子的鉴定以及4）CYP6G4上调表达的杀虫剂抗性效应的研究。研究发现CYP6G4基因调控区上游长度约680bp的MdIS-1插入是家蝇CYP6G4适应性进化的标记。通过启动子报告基因分析发现CYP6G4v1抗性等位基因存在上调CYP6G4基因表达的顺式调控元件，位于转录启始位点上游-143至-134位的“CTTAACTCA”，为CNC/Maf转录因子的结合位点。在家蝇中鉴定了转录因子Cnc的9种变体和2个Cnc非编码RNA,以及Maf基因的2个变体。通过细胞学和凝胶迁移实验证明了CncC 和Maf可以与顺式调控元件相互作用，上调基因的表达。采用重组CYP6G4-CPR酶系证明了CYP6G4具有对多种常用杀虫剂（包括毒死蜱、辛硫磷、残杀威、胺菊酯、溴氰菊脂、啶虫咪等）的代谢活性，CYP6G4的过量表达可以显著提高家蝇和转基因果蝇对残杀威、胺菊酯和啶虫咪的抗药性，但对辛硫磷抗药性降低。.通过完成本项目，我们鉴定可以组成型和诱导型上调CYP6G4表达的顺式作用元件，揭示了DNA插入在生物适应性进化中的意义。明确了与顺式调控元件相互作用的关键调控因子，支持CncC：Maf/KeapI信号途径在P450表达调控中的核心作用。发现CYP6G4具有对杀虫剂广谱的代谢活性，在家蝇抗药性进化中担当重要角色。研究结果在科学上增强了人们对昆虫P450表达调控分子生物学和生物适应（抗药性）进化机理的认识，为P450介导的抗药性提供了平行进化的典型案例；在实践上为家蝇P450介导的抗药性诊断与预警提供分子标记、为家蝇有效控制实践中杀虫剂的精准选用提供依据，为害虫控制剂的研制发现新靶点。.