棉铃虫抗药性相关CYP9A基因的功能研究

The cotton bollworm (Helicoverpa armigera) is a very important polyphagous pest that may cause serious yield losses in many economically important crops. The outbreak of this pest is largely due to its capacity in the detoxification of plant toxins and insecticides. Cytochrome P450s of this pest have been long recognized as very important enzymes in such detoxication process, resulting in rapid evolution of resistance to various classes of pesticides and wide adaptation to a broad range of host plants. However, as of today, only few of the many co-existed cytochrome P450s responsible for xenobiotics detoxification have been rudimentarily functionally characterized in this pest. In this study, we attempt to explore the potential involvement of eight CYP9A genes from H. armigera in the metabolism of plant toxins and pyrethroid insecticides by using approaches of gene recombinant expression and metabolism assay, and probe the amino acids determining their substrate specificity. We believe that the results to be obtained in this project will provide better insights into the molecular basis of host plant adaptation and insecticide resistance, and will be helpful for the development of effective control strategies. The successful establishment of completely lepidoptera-specific P450 monoxygenase systems will be useful for evaluating the metabolic pathway and resistance risk of the currently available or used insecticides, and for developing new control agents.

棉铃虫是重要的多食性农业害虫，其广泛的寄主范围和对各种类型杀虫剂的抗性已成为有效控制该害虫的主要障碍。细胞色素P450（简称P450）被认为在棉铃虫对植物防御性次生物质和化学杀虫剂的代谢解毒中起着至关重要的作用，但其中的生物化学本质与进化机制至今没有得到清楚地阐明。项目组拟采用生物化学与分子生物学的研究手段，选择棉铃虫抗药性相关的8个CYP9A亚家族P450基因为研究系统，在明确这些基因的序列特征和时空表达模式的基础上，剖析它们对26种活性与结构不同但相关的化合物的催化活性,以期查明这些P450在植物次生物质和杀虫剂代谢解毒中的作用,揭示同源P450基因功能分化的进化意义，预测决定底物特异性的关键位点。研究结果有助于在分子水平上阐明棉铃虫对有毒化学环境胁迫适应性的机理，为有效防控棉铃虫提供新思路。棉铃虫P450离体反应体系的建立可为新制剂开发、杀虫剂代谢途径和抗性风险分析提供研究平台。

棉铃虫是一种重要的多食性农业害虫，其广泛的寄主范围和对各种类型杀虫剂的抗性已成为有效控制该害虫的主要障碍。细胞色素 P450被认为在棉铃虫对植物防御性次生物质和化学杀虫剂的代谢解毒中起着至关重要的作用，但其中的生物化学本质与进化机制至今没有得到清楚地阐明。本项目以棉铃虫CYP9A基因的功能为科学问题，从基因表达与蛋白活性两个层面开展研究，首先比较这些P450基因的序列特征和表达模式，再建立单个P450的功能表达体系，在此基础上，采用P450重组酶系测试这些CYP9A蛋白对多种结构和生物活性不同的化合物的代谢活性。. 研究发现棉铃虫不同CYP9A基因在各个发育阶段中的表达模式有所不同，提示这些旁系同源基因存在功能的分化。成功建立了具有完全催化反应活性的棉铃虫细胞色素P450（CYP9A12,CYP9A14,CYP9A17）原核重组表达体系。通过比较不同CYP9A蛋白对模式底物的O-脱烷基活性的酶动力学，揭示了CYP9A家族不同成员间存在功能分化。发现CYP9A具有对生物丙烯菊酯、苄呋菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯、氯菊酯和氰戊菊酯的代谢活性，对近似天然除虫菊素的人工合成的拟除虫菊酯杀虫剂转化效率高、并产生多种产物，而对结构修饰程度高的联苯菊酯只有微弱活性。用代谢实验证明了CYP9A可以快速降解辣椒素，催化作用发生在多个位点，产生多种不同的产物；发现 CYP9A12、CYP9A14和CYP9A17还同时具有对花椒毒素和补骨脂素的代谢活性，但对欧前胡素、异补骨脂素和黄酮没有可检测的活性；CYP9A17具有比CYP9A12更高的α-萘黄酮代谢活性，而 CYP9A14没有检测到此活性。从生物进化角度，明确了进化关系较近的CYPPA12和CYP9A17具有相似的代谢功能，与进化关系较远的CYP9A14 代谢活性差异较大。采用同源建模与底物对接的方法探讨了CYP9A对不同结构的拟除虫菊酯杀虫剂活性差异的结构基础。. 项目取得的研究结果有助于在分子水平上认识棉铃虫对有毒化学环境胁迫适应性的机理，为棉铃虫有效防控提供新思路。