从Rac1-盐皮质激素受体激活途径探讨黄芪菟箭合剂对糖尿病肾病足细胞的保护机制

Podocyte injury and loss is the initial event of albuminuria, which is the clinical hallmark of diabetic kidney disease (DKD). Rac1-mineralocorticoid receptor (MR) activation pathway is a critical mechanism of occurrence and development of DKD, and it mediates podocyte injury and loss. Our previous study showed that Chinese herbal medicine Huangqitujian decoction (HD) has the functions of improving the excretion of albuminuria, protecting podocyte loss and maintaining structural integrity of podocytes. Based on the previous study, applying db/db mice in vivo and cultured podocytes in high glucose in vitro, the present study is to assess the activation of Rac1 and MR by means of GST pull-down and luciferase-reporter assay respectively, after the intervention of HD, and specific inhibitors of Rac1 and MR. Moreover, the study is designed to investigate podocyte loss and apoptosis which are downstream events of the activated Rac1-MR signal pathway. The present study is to conduct a further investigation on HD’s protective effects on podocytes via Rac1-MR pathway activation at a molecular level, and is to provide a new target and laboratory basis for prevention and treatment of albuminuria in DKD.

足细胞损伤及脱失是糖尿病肾病（DKD）出现特征性白蛋白尿的始动环节。足细胞Rac1-盐皮质激素受体(MR)信号途径的激活介导了足细胞脱失和凋亡，是DKD发生发展的重要机制。前期研究证实：黄芪菟箭合剂不仅降低糖尿病大鼠尿白蛋白排泄率，还具有足细胞保护作用。基于此我们提出黄芪菟箭合剂通过Rac1-MR信号途径调控其下游的足细胞凋亡和线粒体氧化应激，保护足细胞的假说。拟采用db/db自发2型DKD小鼠和高糖培养的足细胞，以谷胱甘肽巯基转移酶pull-down技术和荧光素酶报告系统分别检测足细胞Rac1和MR活化，并检测Rac1-MR信号途径激活的下游事件——足细胞线粒体氧化应激及足细胞凋亡相关指标。从整体和细胞水平观察黄芪菟箭合剂对Rac1-MR激活途径及其下游足细胞氧化应激和凋亡的影响，以阐明黄芪菟箭合剂的足细胞保护作用机制，为临床防治DKD蛋白尿提供新的靶点和实验依据。

糖尿病肾病（DN）导致终末期肾功能衰竭，是糖尿病患者的主要死亡原因之一。足细胞损伤对DN发病至关重要。Rac1-MR激活途径与糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）密切相关，其介导线粒体氧化应激、细胞凋亡是DN发病机制中的关键环节。本项目主要研究黄芪菟箭合剂对db/db小鼠和高糖所致的足细胞（MPC5）损伤的保护作用及机制。⑴体内实验：①将db/db小鼠按随机数字表法分成5组:模型组 (Model) 、缬沙坦组（Positive）、黄芪菟箭合剂低、中、高剂量组(Low、Medium、High)，每组 12 只;另取12 只C57BL/6J小鼠作为正常对照组 (Control)。②确立中药治疗效果显著的剂量后，另随机分配4组：模型组 (Model)、芪菟箭合剂高剂量组（HTD）、MR抑制剂依普利酮组（Y）、Rac1抑制剂组（R），各10只，另设正常对照组10只。给药8周后，眼球取血，采集标本。 ELISA测定尿微量白蛋白、尿肌酐；自动生化仪测定TC、TG、LDL等；HE、Masson染色观察肾脏组织病理、纤维化情况，电镜观察肾超微结构变化。RT-PCR、WB和免疫组化观察ZO-1、Nephrin、NFκB P65、P-p65、Rac1、MR氧化应激以及凋亡相关蛋白表达。（2）体外实验：采用高糖（30mmol/L）构建MPC5细胞损伤模型。使用 CytoTox 96 细胞毒性试剂盒检测足细胞在裂解后的乳酸脱氢酶释放率来筛选各药物作用于足细胞的最佳浓度。分化好的足细胞随机分为 5 组，对照组（葡萄糖（glucose，Glu）浓度为 5mmo/L），高糖组（Glu 浓度为 30mmo/L），HTD（Glu 浓度为 30mmo/L，HTD 浓度为 0.75mg/mL），NSC23766 组（Glu 浓度为 30mmo/L，NSC23766 浓度为 1.75uM）以及依普利酮组（Glu 浓度为 30mmo/L，依普利酮浓度为 1.25uM）。免疫荧光染色法定性观察足细胞上标志蛋白 nephrin、ZO-1、RAC1、 MR 、NF-κB和caspase-3的表达水平。结论：黄芪菟箭合剂对db/db小鼠及高糖所致的MPC5细胞损伤具有保护作用，可能通过抑制Rac1-MR 信号传导途径的激活，抑制其下游的足细胞线粒体氧化应和足细胞凋亡发挥作用。