鸭肝炎病毒样颗粒的设计及其免疫原性研究

Duck viral hepatitis(DVH) is one of the most devastating epidemic disease in duck culture industry. Immunization is still the main measures to prevent the disease in the world, but because of the low security and undesirable immune effect, combined with the appearance of different strains, The preventive effect of the attenuated or inactivated vaccines is decreased gradually, so there is an urgent need for new strategy of prevention research. The virus-like particles are hollow particles containing the one or more structural protein of a virus, can be presented to the immune cells as the same way of virus infection, and can effectively induce the body to produce a comprehensive and efficient level of immune response. To explore whether the three structural proteins VP0、VP1、VP3 of duck hepatitis virus (DHV) can assemble into virus-like particles? What are the differences between the virus-like particles and the wild virus particles? Whether the virus-like particles can stimulate a comprehensive and efficient level of immune response in duck body? The project will clone the DHV P1 and 3C genes and express the three structural proteins VP0, VP1, VP3 using baculovirus expression system; preparae, identify and optimize the DHV virus-like particles, and compare them with the wild virus particles ; and then immune ducklings with the virus-like particles, analysize the cellular, humoral and mucosal immune response level, systematically evaluate DHV virus-like particles' immunogenicity. This study will lay the theoretical foundation for the development of new genetically engineered vaccine.

鸭病毒性肝炎是严重危害养鸭业的疫病之一。免疫接种仍是世界各国预防该病的主要措施，但由于普遍存在安全性低、免疫效果不理想等缺点，加之异毒株的出现，预防效果逐渐下降，迫切需要开展预防新策略研究。病毒样颗粒是含有某种病毒的一个或多个结构蛋白的空心颗粒，可通过和病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞，有效地诱导机体产生全面高效的免疫应答水平。为探索DHV VP0、VP1、VP3三种结构蛋白是否能组装成病毒样颗粒？与野毒颗粒有何差异？病毒样颗粒能否在雏鸭体内激发全面高效的免疫应答水平？本项目首先克隆出DHV P1和3C基因，利用杆状病毒系统表达VP0、VP1、VP3三种结构蛋白，制备、鉴定并优化DHV病毒样颗粒，并将其与野毒颗粒进行比较分析；将获得的病毒样颗粒免疫雏鸭，分析其细胞、体液和黏膜免疫应答水平，系统评价DHV病毒样颗粒的免疫原性和保护性。为开发新型基因工程疫苗奠定理论基础。

鸭病毒性肝炎是一种由鸭甲型肝炎病毒 (Duck hepatitis A virus, DHAV) 感染导致的急性和高度致死性传染病，是严重危害养鸭业的疫病之一。免疫接种仍是世界各国预防该病的主要措施，但由于普遍存在安全性低、免疫效果不理想等缺点，迫切需要开展预防新策略研究。病毒样颗粒(virus-like particles, VLPs) 是一种新型基因工程疫苗，由于其能有效地诱导机体产生全面高效的免疫应答，因而受到研究者广泛的关注。.本项目利用杆状病毒/昆虫细胞系统制备DHAV-I VLPs，探讨其免疫原性。我们首先扩增出病毒结构前体蛋白P1和具有蛋白水解酶活性的3CD蛋白，克隆入杆状病毒双表达载体pFastBacDual，常规方法获得重组杆状病毒rBac-P13CD。间接免疫荧光试验说明重组蛋白P1和3CD均获得了正确表达，Western blotting结果表明表达的3CD蛋白能将结构前体蛋白P1成功水解为三个结构蛋白，且大小与预期相符。.将获得的重组杆状病毒rBac-P13CD以MOI为5感染摇瓶培养的Sf9细胞，感染后72h收获细胞，反复冻融三次，离心收集上清，通过过滤、氯仿抽提和超离进行初步纯化。细胞超薄切片电镜实验显示在胞浆中有病毒样颗粒的存在，纯化的DHAV VLPs用磷钨酸负染后，透射电镜观察，可见大小约为20~30nm的空心病毒粒子，Western blotting结果可见三条预期大小的结构蛋白，且能与阳性鸭抗全病毒血清发生特异性反应。以上数据说明结构蛋白VP0、VP1、VP3能在昆虫细胞中自动包装成空衣壳颗粒，且与DHAV病毒颗粒的大小、形态、结构相似。.将纯化的DHAV-I VLPs免疫1日龄雏鸭，10 d后加强免疫一次，并在二免7 d后接种1000 LD50的DHAV-I SH株。间接ELISA和抗体中和实验结果均显示，空衣壳颗粒接种雏鸭后，可诱导产生高水平的抗体水平，淋巴细胞增殖实验结果显示空衣壳颗粒免疫雏鸭后可诱导强烈的脾淋巴细胞增殖反应，攻毒保护实验显示，空衣壳颗粒免疫雏鸭后可保护雏鸭免受致死量病毒的攻击，其效果与减毒活疫苗A66组无差别。.综上所述，我们成功利用杆状病毒/昆虫细胞系统制备了DHAV-I VLPs，该空病毒颗粒能诱导高效的体液和细胞免疫应答，且免疫保护效果与活疫苗相当，为新型鸭肝炎疫苗的研制奠定了理论和技术基础。