E3泛素连接酶NEDD4L通过调控CaMKKβ影响糖尿病肾病肾小管重吸收的机制研究

Renal tubular reabsorption dysfunction is an important early pathophysiological change in diabetic kidney disease (DKD). The previous study of the research group found that E3 ubiquitin ligase NEDD4L may participate in the pathophysiological changes of DKD by degrading its substrate CaMKKβ protein. The ubiquitin-proteasome pathway (UPS) is responsible for the specific degradation of most proteins in cells and is a highly efficient pathway for protein degradation. However, the exact role that UPS plays in DKD is largely unknown. This study suggests that NEDD4L may degrade CaMKKβ by ubiquitination through UPS pathway, affecting mitochondrial function and reabsorption function of renal tubules. This project aimed to prove the mechanism of NEDD4L regulating mitochondrial function by regulating the activity of CaMKKβ/AMPK pathway, and then affecting renal tubular reabsorption. The NEDD4L low expression mice were constructed by lentiviral vector, and histomorphology, cell molecular biology and other experimental methods will be used to observe the effect of inhibiting the expression of NEDD4L on renal tubular reabsorption and to explore related molecular mechanisms. It reveals the mechanism of UPS involved in the development of DKD and seeks new molecular targets for early pathological changes of DKD.

肾小管重吸收功能障碍是糖尿病肾病（DKD）早期重要的病理生理改变。课题组前期研究发现E3泛素连接酶NEDD4L可能通过降解其底物CaMKKβ蛋白参与糖尿病肾病的病理生理变化。泛素-蛋白酶体途径（UPS）负责特异性地降解细胞内大多数蛋白，是一种高效的蛋白降解途径，但在DKD中的作用机制未明。本研究提出NEDD4L可能通过UPS途径泛素化降解CaMKKβ，影响肾小管线粒体功能和重吸收功能。本项目将完善NEDD4L通过调节CaMKKβ/AMPK通路活性而调控线粒体功能，进而影响肾小管重吸收的机制研究；通过慢病毒载体构建NEDD4L低表达小鼠，采用组织形态学、细胞分子生物学等实验方法，观察抑制NEDD4L表达对小鼠肾小管重吸收功能的影响并探索相关分子机制。揭示UPS参与糖尿病肾病发生发展的机制，为糖尿病肾病早期病变找寻新的分子靶点。

糖尿病肾病是导致终末期肾脏病的主要原因。对于糖尿病肾病更应该强调早期发现、早期干预，而阐明糖尿病肾病早期的病变机制将对糖尿病肾病的预防和延缓具有重要意义。肾小管重吸收功能障碍是糖尿病肾病早期重要的病理生理改变。肾脏，尤其是其近端肾小管需要大量的氧以维持代谢，且也是机体含线粒体密度第二高的器官，线粒体功能对维持肾小管重吸收功能具有重要作用。本项目旨在研究E3泛素连接酶NEDD4L通过调控CaMKKβ泛素化降解进而参与糖尿病肾病的作用及机制研究。泛素-蛋白酶体途径（UPS）负责特异性地降解细胞内大多数蛋白，是一种高效的蛋白降解途径，但在糖尿病肾病中的作用机制未明。课题组研究发现CaMKKβ蛋白在糖尿病肾病中表达下降，而过表达CaMKKβ可改善高糖导致的近端肾小管上皮细胞（HK-2）线粒体动力学紊乱和重吸收功能障碍。CaMKKβ/AMPK通路下调可能导致了HK-2线粒体动力学紊乱，进而致重吸收功能障碍。进一步机制研究发现，CaMKKβ蛋白表达下降可能与泛素化降解有关。通过免疫共沉淀实验研究表明，NEDD4L与CaMKKβ之间可能存在蛋白-蛋白相互作用，且二者表达呈负相关，进一步通过腺相关病毒尾静脉注射，构建sh-NEDD4L敲除小鼠，结果表明sh-NEDD4L可在一定程度改善肾脏功能。最后通过细胞实验验证，表明E3泛素连接酶NEDD4L可能通过泛素化降解CaMKKβ蛋白，参与线粒体动力学的调控，进而影响HK-2细胞重吸收功能。本研究揭示了NEDD4L通过泛素化调控CaMKKβ蛋白参与糖尿病肾病发生发展的机制，为糖尿病肾病早期病变找寻新的分子靶点。