谷氨酸及其受体对光学离焦性近视豚鼠视网膜NO-cGMP信号传导通路的调控

本项目以人高度近视眼及离焦性豚鼠近视动物为研究对象，采用分子生物学方法探讨谷氨酸及其受体与其下游视网膜信号通路NO-cGMP在视网膜上传递近视信号、调控近视发生发展的机制。各试验点观察长时间离焦后豚鼠近视视网膜出现病理性改变伴随细胞凋亡，在细胞水平、转录水平和蛋白质水平检测谷氨酸及其受体NMDAR1的表达变化，以及视网膜下游NO-cGMP信号通路的改变；采用靶向NMDAR1siRNA技术使NMDAR1基因沉默，检测其是否通过调控视网膜NMDAR1及NO-cGMP信号通路的表达调节近视。本项目以人近视眼与正常眼为对象初步探讨近视人眼视网膜谷氨酸及其受体NMDAR1与NO-cGMP视网膜信号通路差异性表达，以期证实异常视觉信号导致谷氨酸及其受体的激活，并将信号通过视网膜NO-cGMP传递至靶细胞导致近视形成，为揭示近视眼的发病机制及病因学基因治疗近视眼提供一个全面、崭新的思路。

目的：建立豚鼠形觉剥夺性近视（FDM）动物模型，观察近视豚鼠视网膜的改变，检测视网膜上NMDAR1、 NO及cGMP含量的动态观察，探讨NMDAR1介导的NO-cGMP信号传导通路对近视的调控。玻璃体腔注射NMDAR1反义寡核苷酸，观察其对近视的调控。方法：出生3周豚鼠分为3组：正常对照组、遮盖2周组、遮盖3周组，视网膜检影和A超测眼轴，测量视网膜各层厚度的变化及电镜下组织形态学变化。运用免疫组化及 Western Blot法检测NMDAR1蛋白表达，RT-PCR定量检测NMDAR1的mRNA含量；原位杂交法检测ncNOS的mRNA表达；放射免疫化学方法检测c-GMP含量；并对ncNOS和c-GMP的表达行相关分析。出生3周豚鼠分为A组（空白对照组）、B组（右眼遮盖三周组）、C组右眼遮盖两周时予以玻璃体腔注药1周，根据注药的不同分为：C1组（右眼遮盖3周+ 100ngNMDAR1正义寡核氨酸组）、C2组（右眼遮盖3周+生理盐水组）、C3组（右眼遮盖3周+ 10ngNMDAR1反义寡核氨酸组）、C4组（右眼遮盖3周+ 100ngNMDAR1反义寡核氨酸组）。实验前及实验3周时对各组进行视网膜检影和A超测眼轴，免疫组化法测NMDAR1的蛋白表达变化，RT-PCR定量检测NMDAR1的mRNA含量变化。结果：遮盖2周组，实验眼呈轻度近视，实验眼眼轴较自身对照眼轻度延长。遮盖3周组，实验眼呈中度近视，实验眼眼轴较自身对照眼明显延长。实验眼随形觉剥夺时间延长，近视形成，光镜下视网膜各层变薄，内层细胞数目减少，排列紊乱，电镜下视网膜呈退行性改变并可见凋亡小体。遮盖2周组与遮盖3周组：实验眼视网膜NMDAR1 、ncNOS和c-GMP表达随遮盖时间延长明显上调，视网膜ncNOS和c-GMP之间表达具有高度相关性。B组及所有C组右眼呈近视状态，眼轴较自身对照眼延长。C2、C3、C4组遮盖眼近视屈光度数下降；眼轴延长减慢,NMDAR1的蛋白含量和mRNA含量下调。结论：形觉剥夺可导致豚鼠近视形成，视网膜变薄并出现凋亡。形觉剥夺可明显上调豚鼠视网膜NMDAR1的蛋白水平及mRNA的表达，伴随ncNOS的mRNA上调和cGMP含量升高。NMDAR1反义寡核氨酸玻璃体腔注射能通过下调NMDAR1的蛋白含量及mRNA表达，减缓近视的进展。