c-Src介导金黄色葡萄球菌内化入成骨细胞的分子机制研究

Internalization and colonization of staphylococcus aureus (S.aureus) in osteoblasts is a key cause for continuous inflammation and repeated infection in patients with chronic osteomyelitis, and a treatment challenge for the orthopaedic surgeons as well. The underlying mechanisms how S. aureus internalizes into osteoblasts remain to be elucidated. Increasing evidence indicates that adhesion of S. aureus activates F-actin reorganization and internalization of the bacteriae. Our recent progress has demonstrated that S. aureus infection in vitro can activate c-Src phosphorylation, and that blocking c-Src can inhibit F-actin reorganization induced by S. aureus, and blocking Rac1& Cdc42 can inhibit internalization of S. aureus. In addition, α-hemolysin, the secreted toxin by S. aureus, further activates c-Src and promotes internalization process. Based on our previous studies and other related work, it can be hypothesized that activation of c-Src/FAK/Rac1&Cdc42 might initiate the internalization of S. aureus and α-hemolysin might promote this process by activating ADAM10 and c-Src. This project aims to clarify the effects of S. aureus internalization on bone metabolism in vivo, and to demonstrate the underlying molecular mechanisms how c-Src/FAK/Rac1&Cdc42 mediates the adhesion-initiated and α-hemolysin-promoted internalization of S. aureus. Launch of our project will reveal molecular mechanisms underlying internalization of S. aureus in osteoblasts, eventually leading to development of early therapeutic targets and strategies for chronic osteomyelitis caused by S. aureus.

金黄色葡萄球菌（金葡菌）内化并定植成骨细胞是造成慢性骨髓炎持续炎症和感染反复发作的关键，是临床骨科治疗的难题，其分子机制尚未揭示。有研究表明，金葡菌黏附于成骨细胞外基质可激活F-actin组装并启动该菌内化。我们研究发现，阻断c-Src或Rac1&Cdc42可抑制金葡菌所诱导的F-actin组装或内化，且该菌毒素α-溶血素（α-Hemolysin）可促进c-Src磷酸化及细菌内化。综合文献推测，c-Src/FAK/Rac1&Cdc42可能介导金葡菌黏附所启动的细菌内化，α-溶血素通过激活c-Src而促进金葡菌内化。本项目拟在整体动物研究金葡菌内化入成骨细胞对骨代谢的影响，进而在细胞和分子水平，证实c-Src/FAK/Rac1&Cdc42介导细菌黏附所启动的内化及α-溶血素的促进内化作用，阐明金葡菌内化入成骨细胞的分子机制，为探索金葡菌感染性慢性骨髓炎的早期防治分子靶标和治疗策略提供新思路。

金黄色葡萄球菌（金葡菌）内化并定植在成骨细胞是造成慢性感染性骨髓炎持续炎症和感染反复发作的重要因素之一，其机制尚未揭示。本项目发现并明确了金葡菌的成骨细胞内化和定植以及α-溶血素激活膜脂筏在慢性感染性骨髓炎病程中的作用。我们发现：在小鼠金葡菌感染性骨髓炎慢性期，金葡菌在成骨细胞内的定植与感染所致持续性骨破坏相关。离体细胞实验显示，金葡菌呈时间依赖性激活成骨细胞的EGFR信号、FAK及c-Src通路，阻断EGFR/FAK或c-Src通路可显著抑制金葡菌内化入成骨细胞。此外，金葡菌分泌α-溶血素可以激活骨髓基质细胞Caveolin-1的表达和细胞膜脂筏的形成，抑制成骨细胞的定向分化。进一步在α-溶血素处理的小鼠模型和金葡菌感染性骨髓炎小鼠模型上研究发现，细胞膜脂筏抑制剂甲基环糊精（300mg/kg，腹腔注射）联合抗生素可显著改善骨破坏。我们基于公共转录组数据GSE30119和课题组数据GSE166522分析及实验研究还发现，金葡菌感染患者的外周血单核细胞和小鼠感染性骨髓炎骨髓组织中均高表达G-CSF等炎症因子；深入研究发现，金葡菌通过NF-κB激活巨噬细胞TWIST1，进而促进骨髓感染局部的巨噬细胞迁移和吞噬，同时激活巨噬细胞G-CSF表达；采用G-CSF中和抗体可以显著改善金葡菌感染所致骨破坏。上述结果明确了巨噬细胞在金葡菌感染亚急性期募集的双重效应：防御功能和过度炎症导致骨破坏。最后，我们还发现金葡菌感染大鼠或骨髓炎患者的血清囊泡的粒径显著增加，并可引起相应细菌的特异性凝集，利用血清囊泡的该特性可实现相应感染的早期诊断。综上，本项目阐明了EGFR/FAK和c-Src在金葡菌内化入成骨细胞中的作用机制及细胞膜脂筏在慢性金葡菌感染性骨破坏中的重要作用，发掘了巨噬细胞NF-κB/TWIST1信号促进其在感染局部募集和吞噬的作用及其所产生的G-CSF在金葡菌感染亚急性期的骨破坏作用，发现并证明了血清囊泡在感染早期的诊断价值。系列研究结果对于推进感染性骨髓炎的早期诊断和治疗提供了重要实验依据。