SmpB介导异硫氰酸苄酯对金黄色葡萄球菌的杀菌机制研究

Staphylococcus aureus endanger public health by contaminating food. Benzyl isothiocyanate (BITC) shows excellent bactericidal efficacy against S. aureus strains. However, the mechanism underlying its bactericidal activity remains unclear. Through data analysis of transcriptome, WGCNA and other bioinformatics, we identified SmpB as a vital factor causing cell death during the bactericidal process of BITC against S. aureus. We speculate that BITC affect the normal trans-translation process by specifically targeting SmpB and induce ClpX protease system to initiate cell death. In this study, the interaction between SmpB and BITC will be confirmed by isothermal titration calorimetry (ITC) and western blot, and the sites targeted by BITC will be identified based on the ability of site-directed SmpB mutant interacting with BITC in vitro. The cell death pathway via SmpB will be revealed by constructing mutants of S. aureus, biological phenotypic analysis and quantitative fluorescence PCR. The knowledge in the mechanism underlying the cell death of S. aureus by BITC will theoretically support the application of BITC in the treatment of incidents by S. aureus, and provide the target for the development of new drugs.

金黄色葡萄球菌污染食品，危害人们健康。异硫氰酸苄酯（BITC）对金黄色葡萄球菌的杀菌效果显著，但其杀菌机制尚不清楚；申请者通过转录组测序、WGCNA分析及其它生物信息学分析研究发现SmpB是介导BITC杀死金黄色葡萄球菌的关键蛋白。分析结果显示BITC可特异性靶向结合SmpB，影响反式翻译，诱导ClpX蛋白酶系统启动细胞死亡进程。本研究拟通过等温滴定量热法及Western blot杂交验证并明确BITC与SmpB互作关系及位点；通过构建金黄色葡萄球菌SmpB突变体，研究其生物学功能，揭示SmpB介导BITC杀死金黄色葡萄球菌的主要途径。阐明BITC诱导金黄色葡萄球菌细胞死亡的分子机制，既可为BITC控制金黄色葡萄球菌污染提供理论指导，又可以为新型杀菌剂的开发提供靶标。

多重耐药金黄色葡萄球菌污染已成为全球关注的食品安全及公共健康问题。异硫氰酸苄酯具备清除金黄色葡萄球菌的巨大潜力。（1）本项目研究发现异硫氰酸苄酯对标准金黄色葡萄球菌菌株ATCC25923和临床上MRSA菌株表现出良好的杀菌效果，MIC均为10 μg/mL。通过扫描电镜观察、碘化丙啶（PI）荧光探针标记，结合流式细胞仪分析确定异硫氰酸苄酯可以杀死金黄色葡萄球菌细胞。通过转录组测序、WGCNA分析以及生物信息学分析等确定EfeB、GroES、SmpB和Lsp作为异硫氰酸苄酯诱导金黄色葡萄球菌死亡的潜在靶点蛋白。（2）通过非标蛋白质组定量技术，共筛选出88个差异蛋白。进一步借鉴修饰蛋白组学思维，共鉴定出99个BITC作用位点，涉及到53个BITC共价修饰蛋白。这53个蛋白主要涉及到细胞耐药、解毒、遗传信息传递等生物功能，参与到代谢通路和细胞过程通路等代谢途径。结合生物信息学分析及文献挖掘，发现BITC修饰蛋白DEAD-box RNA 解旋酶、脂蛋白、转录起始因子、ATP结合蛋白等与金黄色葡萄球菌死亡密切相关，揭示了BITC的多靶点抑菌机制。（3）针对BITC易挥发易降解水溶性低等特性，采用较为常见且成熟的环糊精包合药物改良技术对BITC进行包合以降低其挥发性，提高稳定性及水溶性，提高其生物利用度，扩大其在食品工业中的应用范围。此外本研究筛选使用黄原胶/刺槐豆胶/魔芋胶/卡拉胶制备了BITC复合水凝胶（BITC-XLKC-Gel）。BITC-XLKC-Gel水凝胶具备多孔结构，且具有高抗菌活性，且具有良好的流动性和3D打印可塑性。通过烧伤皮肤抗菌试验，发现BITC-XLKC-Gel水凝胶可以有效抑制细菌生长，有望成为治疗烧伤创面的一种有前途的水凝胶敷料，展现出BITC良好的抗菌应用潜力。