nucleolin介导EV71病毒入侵细胞的动态过程和机制研究

Enterovirus serotype 71 （EV71）is the major causative agent of human Hand, Foot and Mouth Disease(hHFMD) which threatened the health of infants. As an important receptor of EV71, how nucleolin mediated the infection of EV71 remains to be elucidated. In this program, we will study the cell entry process and mechanism of EV71 through virus labeling and dynamic visualization tecthnology, combining with traditional biological strategies. We will focus on the trans-membrane transport, the vesicular transport and the uncoating and RNA release process of EV71 during nucleolin mediated infection. This program would help to understand the infection mechanism and pathogenesis of EV71, and provide useful information for anti-EV71 research.

EV71病毒是人手足口病的主要病原，严重威胁我国婴幼儿身体健康和生命安全。已有研究发现，nucleolin作为EV71病毒的受体分子，可以介导病毒入侵敏感细胞。但nucleolin介导EV71病毒入侵细胞的具体机制尚不清楚。本项目拟通过病毒标记和感染可视化方法，实时观察量子点标记的EV71病毒入侵表达nucleolin细胞系的全过程，重点研究nucleolin介导的EV71病毒跨膜转运过程、囊泡运输过程、脱衣壳释放核酸过程，同时结合经典生物学研究手段，解析nucleolin介导病毒侵染细胞的入侵途径。本项目的完成，将为深入理解EV71病毒侵染细胞机制和抗病毒研究提供新的理论基础。

EV71病毒是婴幼儿手足口病的主要病原，可以利用多种受体感染宿主细胞，病毒的受体选择偏好是其致病性的关键。本项目主持人发现，原计划研究的受体ANXA1在EV71感染中的作用较弱，而另一受体硫酸乙酰肝素（HS）发挥这更为重要的作用。EV71病毒在体外传代过程中可以适应性突变逐渐获得结合HS的能力，从而增强在体外培养细胞中的复制水平，但显著削弱病毒在小鼠中的致病性。其复制水平和致病性的变化与其受体结合特性密切相关，但其具体机制仍需深入研究。使用病毒标记示踪技术有望揭示解决上述问题。但是常规化学标记技术多是通过病毒粒子表面极性氨基酸侧链来实现荧光标记，极易影响病毒与受体的结合，荧光蛋白融合等生物学标记技术对病毒结构蛋白功能影响较大，不适用于EV71等粒径较小的病毒粒子。本项目主持人建立了一种基于甲硫氨酰合成酶突变体MetRS-L272G及非天然氨基酸ANL的新型标记技术，该技术可以在病毒复制过程中实现对代谢性标记，操作简便，对病毒感染性无显著影响。申请人利用该技术成功对野生型及毒力位点突变型EV71进行了荧光标记，并对此前研究中毒力相关位点作用机制进行了初步验证，发现HS可以增强病毒在细胞表面的吸附；在SCARB2存在的情况下，EV71病毒与硫酸乙酰肝素的结合可以促进病毒的复制；但HS单独存在时，硫酸乙酰肝素可以介导EV71病毒的高效吸附，但不足以支持病毒进行有效复制。上述研究建立了一种新型病毒标记技术，并揭示了硫酸乙酰肝素和SCARB2两种受体在EV71病毒感染过程中的具体作用，目前相关论文已发表于Viruses、Journal of nanobiotechnology上。