YTHDF2通过转录后调控m6A修饰的NKX3.1介导AKT/GSK3β通路在前列腺癌中的作用及分子机制研究

N6-methylated-adenylate (m6A) modification is the most common methylation for RNA. m6A plays an important role in many physiological and pathological processes, however, its function is still unclear in prostate cancer. In our previous experiments, knock down of m6A "reader" protein YTHDF2 significantly inhibited proliferation and metastasis of prostate cancer cell lines, and elevated mRNA m6A modification level. Moreover, NKX3.1 was identified as a potential target of YTHDF2 by MeRIP high-throughput sequencing. In this project, we will verify the association among YTHDF2, NKX3.1, etc. and their relationships with clinical data in prostate cancer via large clinical samples. MeRIP, CLIP etc. will be used to clarify the molecular mechanism of post-transcriptional regulation of NKX3.1 based on YTHDF2 on different m6A levels. The role of YTHDF2 and NKX3.1 in regulation of prostate cancer via AKT/GSK3β signaling pathway will be verified in vivo and in vitro. Clarification of regulation mechanism of YTHDF2 on m6A modified NKX3.1 will provide scientific basis to clarify the exact role of m6A modification in prostate cancer, and explore new pathogenesis and therapeutic target in prostate cancer.

N6-甲基化-腺苷酸（m6A）修饰是RNA最常见的甲基化修饰，参与许多重要的生理和病理过程，但其在前列腺癌中的作用尚未明确。项目组前期研究发现，在前列腺癌中沉默m6A结合蛋白YTHDF2能够抑制癌细胞的增殖和转移，提高总mRNA m6A修饰水平，进一步利用MeRIP-seq等高通量测序技术筛选出YTHDF2潜在的靶基因NKX3.1。本项目拟在前期工作基础上，利用临床大样本验证前列腺癌中YTHDF2、NKX3.1等指标之间的关系及其与临床数据的相关性；利用MeRIP、CLIP等技术在不同m6A修饰水平上探索YTHDF2转录后调控NKX3.1的分子机制；利用体内体外实验明确YTHDF2通过调控NKX3.1介导AKT/GSK3β通路在前列腺癌中的作用。阐明YTHDF2对m6A修饰的NKX3.1的调控机制，为揭示m6A修饰在前列腺癌中的作用，探寻前列腺癌新的发病机制和治疗靶点提供科学依据。

前列腺癌是欧美国家男性发病率最高的恶性肿瘤。去势抵抗性前列腺癌以及转移性前列腺癌患者的生活质量与预后差，严重危害老年男性健康。而对其治疗也一直是泌尿外科的棘手问题，为明确其具体分子机制为早期诊断与治疗前列腺癌显得尤为重要。RNA m6A是发生于RNA腺苷酸第6位N元素上的甲基化修饰，本质上，m6A是一个由甲基化酶复合体催化形成甲基，下游RNA识别蛋白（Reader）结合执行功能，以及可以被去甲基化酶消除的动态可逆性过程。在此过程中Reader作为修饰执行介导者在实现功能表型上起到重要作用。越来越多的证据表明，m6A修饰参与了众多疾病过程，尤其是肿瘤。YTHDF2作为最早发现的Reader在m6A介导的调控中发挥重要作用，其主要通过靶向识别m6A修饰的mRNA并诱导其降解。. 本研究证实：（1）YTHDF2以及METTL3在前列腺癌组织/细胞中均显著上调，并且与Gleason评分、肿瘤分期相关。高表达YTHDF2或METTL3的患者均具有更低的总体生存率；（2）敲低YTHDF2显著上调RNA总m6A水平，而敲低METTL3则显著下调RNA总m6A水平。敲低YTHDF2或METTL3均促进细胞凋亡、抑制细胞增殖与迁移能力，并且伴随AKT磷酸化水平下调。裸鼠实验同样证实上述结果；（3）YTHDF2可以直接靶向降解LHPP与NKX3-1 mRNA，敲低YTHDF2显著提高LHPP与NKX3-1的mRNA与蛋白水平，RIP证实YTHDF2可以直接结合LHPP与NKX3-1 mRNA。敲低METTL3后同样可以上调LHPP与NKX3-1 mRNA与蛋白水平，MeRIP-RT-qPCR验证敲低METTL3后显著抑制LHPP与NKX3-1的m6A水平；（4） YTHDF2靶基因LHPP在前列腺癌组织与细胞中均显著下调，过表达LHPP后能够促进前列腺癌细胞凋亡、抑制细胞增殖与迁移，并且同样可以阻断AKT磷酸化。最终AKT磷酸化作为METTL3/YTHDF2/LHPP/NKX3-1轴作用的共同终末靶点，促进前列腺癌进展。. 本研究揭示了前列腺癌中显著上调的YTHDF2预示更差的总体生存率，并且YTHDF2通过m6A依赖方式靶向降解LHPP与NKX3-1，并通过其下游抑制AKT磷酸化，最终促进前列腺癌增殖与转移。我们希望该研究为前列腺癌发生发展提供新的机制。