慢病毒介导SOX9基因高表达及基因沉默对间充质干细胞软骨分化影响的研究

利用特定基因修饰间充质干细胞（MSCs），使其表达功能蛋白，促使MSCs向软骨定向分化，是组织工程方法修复关节软骨损伤的重要进展。目前方法多采用生长因子基因转染MSCs，存在软骨、滑膜、肌肉等组织退变的严重副作用。SOX9是软骨发育形成中重要的转录因子, 在胚胎软骨发生和成熟过程发挥重要调节作用，是软骨形成中必需的调节基因，可促使未分化的胚胎干细胞向软骨方向分化。但SOX9是否能对成年个体MSCs也产生类似作用尚不明确。若SOX9基因修饰MSCs能直接启动软骨分化过程，则可避免使用生长因子基因转染带来的副作用，有利于基因修饰MSCs的临床应用。本研究拟利用慢病毒作为载体介导SOX9基因高表达，利用RNA干扰技术造成SOX9基因沉默，观察SOX9基因对成体MSCs成软骨分化的影响，通过细胞基因表达谱和蛋白表达谱的变化分析其作用机制，为利用SOX9基因修饰MSCs修复关节软骨损伤提供研究基础。

组织工程技术的建立和发展，为修复软骨损伤带来了新的希望，通过SOX9基因转染，使间充质干细胞高表达SOX9，可能直接启动和激活间充质干细胞的软骨分化过程，从而避免由于生长因子过度作用而产生的副作用，如果此设想能被验证，将会为MSCs向软骨方向定向分化找到新的方法，为修复软骨损伤探索新的途径。本课题做为验证以上假设，首先对MSCs进行分离纯化，利用流式细胞术和多向分化能力实验对细胞进行鉴定，采用细胞微团法进行软骨诱导分化，观察MSCs软骨分化过程中SOX9表达变化规律；进一步采用重组慢病毒介导SOX9高表达并利用RNA干扰技术造成SOX9基因沉默细胞模型；最后通过基因芯片方法分析SOX9基因高表达和基因沉默后细胞基因表达谱的变化，阐述SOX9在MSCs软骨分化过程中的作用机制。.研究结果显示通过差速贴壁培养法可以较为迅速筛选出MSCs，这些MSCs能够在体外不同诱导条件下分别向成骨、成脂肪、成软骨方向多向分化，传代多次的细胞仍有多向分化能力，但传代多次后MSCs成软骨的能力有所下降。体外培养诱导MSCs向软骨分化过程中SOX9及II型胶原在mRNA及蛋白表达趋势一致，均随着诱导时间的延长，成正相关关系。在体外小鼠MSCs三系分化中，SOX9基因均有表达，但软骨分化中的表达明显高于成骨分化和成脂肪分化。完成了慢病毒SOX9过表达载体及SOX9 RNAi载体的构建和对MSCs转染的研究工作。成功构建了SOX9过表达载体及SOX9 RNAi载体，并经过酶切和基因测序验证载体，体外进行了MSCs转染工作，经过GFP绿色荧光蛋白流式细胞术验证基因转染效率分别76.6%和80.6%，经蛋白印迹实验验证细胞转染成功。采用基因芯片技术对转染成功的小鼠间充质干细胞进行全基因组表达谱的分析。对于差异基因进行GMSA分析（包括GO、Pathway等分析）结果显示Sox9过表达（OE）后699基因个上调，792个基因下调（P<0.05），Sox9 RNAi（KD）后有832基因个上调，753个基因下调（P<0.05）。对于前两者差异基因进行合并分析，选出OE上调而KD下调的基因16个，以及OE下调而KD上调的基因28个。对这些差异基因进行生物信息学分析，包括biological process、cellular component、molecular function和pathway等。结