慢病毒介导Cx43基因修饰骨髓间充质干细胞在异基因造血干细胞移植后免疫调控机制的研究

Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT) is one of the most effective means for the treatment of malignant hematological disorders, but limited by the complex immunological reaction between donors and recipients cells, the acute graft-versus-host disease (aGVHD) has become a major problem affecting the post-allo-HSCT curative efficacy, especially. Recent research demonstrates that mesenchymal stem cell (MSC) have immunoregulatory effects after the allo-HSCT, and the MSC-based therapeutic regimens can have a actively negative regulation on aGVHD. In our previous studies, the loss or depression of gap junction intercellular communication (GJIC) was found to result in the dysfunction of hematopoietic tissues and organs, but which can be repaired through the overexpression of connexin 43 (Cx43) in hematopoietic cells by genetic engineering so as to increase the communication among the cells and harmonize the functions of the cells. So we conceived to construct stable bone marrow MSCs modified by Cx43 gene to import into bone marrow transplantation aGVHD model, and to establish a stable mixed chimera to induce immune tolerance after transplantation, so that we can try to make an in-depth exploration for the immunobiological effects after allo-HSCT in order to ultimately provide a strong experimental evidence for the potential new strategy on the prevention and treatment of GVHD.

异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）是治疗血液系统恶性疾病的最有效手段之一，但受困于移植后供受者之间复杂的免疫反应，其中急性移植物抗宿主病（aGVHD）已成为影响移植疗效的主要问题。最新研究证实，间充质干细胞（MSC）在allo-HSCT后有免疫调控作用，基于MSC的移植治疗方案对aGVHD有积极的负调控作用。而在前期的工作中，我们发现间隙连接细胞间通讯（GJIC）功能降低或缺失会导致造血组织和器官的正常功能损害，通过基因工程使造血细胞过表达间隙连接蛋白Cx43，可增加造血组织细胞之间的沟通，平衡协调组织细胞间的功能。于是我们设想通过构建Cx43基因修饰骨髓来源间充质干细胞，导入骨髓移植aGVHD模型中，在该模型中建立稳定的混合嵌合体，诱导移植后免疫耐受，力图深入探索allo-HSCT后的免疫生物学效应，最终为潜在的GVHD防治新策略提供有力的实验证据。

异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后合并移植物抗宿主病(GVHD)已成为影响移植疗效的主要问题，基于间充质干细胞MSC的治疗方案对GVHD有免疫负调控作用，而间隙连接蛋白43 （connexin 43，Cx43）可增加造血组织细胞之间的沟通，平衡协调组织细胞间的功能，客观上具有诱导免疫耐受的作用。为此，本研究项目的结果包括：（1）成功按照全骨髓贴壁法分离培养小鼠骨髓来源MSC，不同培养基接种传代，获得小鼠骨髓来源MSC最适培养基，优化选择传代生长MSC，建立了保持生物学特性稳定、高效的小鼠MSC细胞体系。对不同培养基体外诱导的部分离体培养MSC向内皮细胞、脂肪细胞及成骨细胞等分化过程，进行免疫细胞化学染色、分化细胞形态、超微结构与表型等检测，初步鉴定出具MSC分化增殖潜能的细胞系。（2）成功将小鼠Cx43基因连接到含有慢病毒表达载体pHBLV-CMVIE- IRES-ZsGreen中，获得重组慢病毒载体质粒pHBLV-CMVIE-IRES- ZsGreen-Cx43。将该重组载体和包装质粒共同转染293FT细胞，进行病毒包装和生产，收集、浓缩病毒液后测定滴度为1×108 /ml，RT-PCR鉴定Cx43基因在293FT细胞的表达明显增加。此后通过Cx43慢病毒载体转染小鼠离体培养MSC细胞体系，获得了最适Cx43基因转染MSC细胞体系，对转染后MSC中Cx43的蛋白含量在转染前后表达变化的检测， Cx43目的蛋白的表达增多。（3）完成建立 C57BL/6 小鼠（雌性）→BALB/c 小鼠（雄性）骨髓移植GVHD 模型，获得理想的小鼠骨髓移植GVHD模型。将Cx43基因转染MSC细胞系与小鼠骨髓移植GVHD模型行共移植，以慢病毒空载体转染MSC作为对照，受鼠精神、饮食、体重和活动等一般状况恢复与对照组无差别，外周血白细胞、血小板和造血器官恢复较对照组增快，生存曲线延长，T淋巴细胞亚群检测免疫功能可见受鼠组CD4+T淋巴细胞较对照组增加，CD8+T淋巴细胞减少，受鼠组外周血细胞因子检测示mIL-2、mIL-6、mINF-γ及mINF-α较对照组减低，而mIL-10、mIL-4相应增高。提示Cx43慢病毒载体转染MSC可促进小鼠allo-HSCT后造血重建和免疫重建，改善受鼠长期生存，并对诱导allo-HSCT后GVHD的免疫耐受有一定的作用。