猪小肠上皮细胞中内质网应激相关蛋白GRP78/Bip变化规律及其与细胞凋亡的关系研究

Stress induced by early weaning results in impaired mucosal barrier function and metabolic disorder in piglets. This is a significant problem because it affects the growth and development of young pigs and causes enormous economic losses in the swine industry. However, the moleclar mechanims through whcih the mucosal barrier function was affaceted is not well known. GRP78/Bip (Glucose-regulated protien 78/Binding immunoglubulin protein) is a critical regulator of ER stress signaling pathways which is assocaited with multiple biological proceses, such as introcellular homestasis and apoptosis. It is not clear whether GRP78/Bip is invovled in the apoptosis of intestinal epithelial cell in early weaning piglets. In this study, the expression profile of GRP78/Bip, PERP, IRE1、ATF6, as well as apoptotic proteins (CHOP、Caspase 12、PARP） will be determined in early weaning small pigs by using of mulitiple technolgies, such as DNA array, Real-time PCR, western blotiing and Immunohistochemical staining. We will also try to eclucidate the underlying molecular mechanisms of apoptosis in small intesitnal epithelial cells. Our result will not only generate basic knowledge about a functional role of endoplasmic recticlum stress in maintaining of the integrity of mucosal barrier function, but will also be invovled in endoplasmic reticulum stress induced apoptosis in piglets.

猪小肠粘膜上皮细胞凋亡是断奶仔猪小肠结构和功能异常的主要原因之一，严重影响着仔猪生长发育，但其分子机制尚未阐明。葡萄糖调节蛋白(GRP78/Bip)作为内质网应激(ERS)重要的调节因子，在维持内质网生理功能、内环境稳态、介导ERS引起的细胞凋亡方面起着重要作用。然而断奶仔猪小肠粘膜上皮细胞中GRP78/Bip的变化规律及其与细胞凋亡的关系未见报道。本项目拟采用体内、体外（猪小肠上皮细胞体外培养）相结合的方法，应用转录组学、免疫组化、免疫印迹、流式细胞分析技术，检测仔猪小肠粘膜上皮细胞中GRP78/Bip、内质网应激感受蛋白（PERP、IRE1、ATF6）、细胞凋亡相关蛋白(Caspase、PARP)表达变化规律，并对GRP78/Bip调节小肠上皮细胞凋亡的可能分子机理进行探讨。研究结果将为阐明内质网应激信号分子在维持小肠上皮细胞结构和功能中作用提供重要的理论依据。

猪肠上皮细胞对仔猪的生长发育及营养物质吸收利用起着非常重要的作用。在当代养猪生产中，常通过早期断奶提高规模化猪场的繁殖效率。早期断奶仔猪，尤其是在断奶后的第一周，采食量明显降低、体增加变缓、生长发育受阻、仔猪免疫力下降、对病原菌易感性增强，常出现腹泻、甚至死亡，称为断奶应激综合症。如何减少断奶应激对仔猪生产带来的不良影响，一直是从业者及科技工作者关心的问题。我们前期的研究发现，同哺乳仔猪相比，断奶仔猪线绒毛萎缩、脱落明显、肠上皮细胞间紧密连接蛋白表达减少，肠通透性增强。肠上皮功能由于具有更新快，并且需要合成大量的分泌蛋白。内质网是蛋白质加工修饰的主要场所，内质网应激相关蛋白在猪肠上皮细胞中的表达，及其与细胞凋亡的关系并不清楚。我们的研究发现，断奶三日龄仔猪空肠上皮细胞内质网功能出现异常，GRP78，ATF6等多个蛋白表达明显升高，细胞凋亡明显增加。而在补充1%的谷氨酰胺后，这种变化得到明显缓解，断奶应激引起的多个细胞因子的表达上升也得到明显抑制。断奶应激能够上调与蛋白质降解相关的基因的表达（FBXO32、 MSTN、MuRF），给仔猪补充氨基酸能够在一定程度上缓解蛋白质周转相关基因的表达。体外研究表明，内质网应激条件下，猪肠上皮细胞凋亡明显增加，并呈现明显的时间与剂量依赖性，内质网相关蛋白ATF4、ATF6、HSPA5、XBP1S、DDIT3的mRNA表达均升高，与肠上皮通透性密切相关的多个紧密连接蛋白表达降低。mTORC1抑制剂能够进一步增加内质网应激引起的细胞凋亡。研究结果为对于通过氨基酸营养改善仔猪肠道健康，提供了实验依据。