CaSR介导MAPKs/Cytc/Caspase-3通路调控青少期应激中缝背核5-HT能神经元可塑性及调肝治法干预作用研究

Based on the previous studies on the treatment of the effect of adolescent stress and emotional diseases from the liver, closely combined with the new discovery of the brain regions’ CaSR-mediated neuron growth, apoptosis and neurotransmitter synthesis and release, and then further study on the plasticity of the “dorsal raphe nucleus” in the 5-HT key brain area and the intervention of the liver regulating treatment method and the possible mediating pathway of CaSR. The model of Maternally separated and primary culture 5-HT neurons would be as the object of observation, using Laser confocal, calcium ion imaging optical fiber recording, Western-blot, RT-PCR, high performance liquid chromatography, immunofluorescence and other means. From the localization and functional expression of CaSR, Steady state regulation of Synaptic Ca2+, apoptosis of “Mitochondrion - Death Receptor- Endoplasmic Reticulum Stress”, and so on. Then, taking MAPKs/Cyt.c/Caspase-3 as the main index, a new potential target for depression mechanism is tried to clarify. The group would be used classical prescriptions Sini San to set High, medium and low dose groups, which is to research the possible target to carry out the central mechanism of liver-regulating prescription from the above step; Using CaSR agonist(GdCl3),inhibitor(NPS-2390) and block L-calcium channels and Sodium-Calcium exchanger, to evaluate the “precise” intervention effect of CaSR on neurons.

立足青少期应激效应与情志病从肝论治的前期研究，紧密结合脑区CaSR介导神经元生长、凋亡与递质合成释放的新发现，深入开展5-HT关键脑区“中缝背核”可塑性及调肝治法方药干预作用及CaSR可能介导通路的研究。以母子分离模型、原代培养5-HT神经元为观察对象，采用激光共聚焦、钙离子成像技术光纤记录、Western-blot、RT-PCR、高效液相、免疫荧光等手段，从CaSR的定位与功能表达、突触内Ca2+穏态调节、“线粒体-死亡受体-内质网应激”凋亡等入手，以MAPKs/Cyt.c/Caspase-3等为主要指标，尝试阐明抑郁机制新的潜在靶点。设置经典方剂-四逆散高、中、低剂量组别，针对上述环节开展调肝方药中枢作用机制的可能靶点研究；运用CaSR激动剂（GdCl3）、抑制剂（NPS-2390）及阻断L-型钙通道和钠钙交换等方式，评判CaSR对神经元影响的“精准”干预效应。

探查肝调畅情志“中枢调控”作用的关键脑区及其变化，揭示相关病证（抑郁等）从肝论治临床疗效的具体靶点，仍是情志病证防治研究的前沿内容。针对一线抗抑郁药物-选择性5-HT再摄取抑制剂普遍存在“起效延迟”效应，提示仍需关注5-HT合成分泌中枢“中缝背核”的自身改变：突触可塑性。钙敏感受体(CaSR)在中枢突触可塑性和神经信号传导具有重要作用，可促进轴突生长和树突分枝发育，介导细胞凋亡和分化，CaSR及其介导的信号通路可能成为抑郁治疗的重要潜在靶点。本研究采用母婴分离联合成年期/青少期慢性不可预知温和应激抑郁模型，探索调肝方药四逆散对中缝背核等抑郁关键脑区CaSR介导通路及突触可塑性相关蛋白的作用机制研究。结果提示：1）早期应激抑郁大鼠在成年二次应激刺激下，可加重抑郁症状，四逆散干预可显著改善应激大鼠一般情况、皮质与海马CA1区尼氏体数目，CaSR、PKC、ERK1/2及突触相关蛋白表达。2）四逆散干预可通过上调CaSR-PKC-ERK1/2信号通路调节MS+CUMS大鼠突触可塑性发挥抗抑郁作用。3）母婴分离联合青少期慢性应激可诱发大鼠抑郁样行为，模型大鼠中缝背核CaSR蛋白表达降低，正常大鼠给CaSR抑制剂表现出一定的抑郁样行为，CaSR激动剂可调控中缝背核Spinophin、PSD95和SYN蛋白表达水平、病理结构、突触超微结构减少抑郁样行为，四逆散干预可通过CaSR介导调控上述改变发挥抗抑郁作用。4）离体实验发现，CaSR可能参与皮质酮诱导PC12细胞凋亡过程，四逆散含药血清可通过抑制皮质酮引起的凋亡蛋白表达量增加及蛋白激酶p-JNK活化发挥抗抑郁效果。综上，调肝治法方药四逆散可通过调控应激抑郁大鼠中缝背核、皮质与海马区CaSR及突触相关蛋白表达、皮质与海马CA1区CaSR-PKC-ERK1/2信号通路与神经细胞C-Caspase3、Cytochrome C等凋亡蛋白表达量以发挥抗抑郁疗效。负性应激对个体精神心理行为可产生不良影响，增加或导致抑郁症的发生。本研究成果模拟复合应激下肝失疏泄、情志内伤抑郁，丰富与完善了四逆散抗应激抑郁的机制研究，为临床治疗各年龄阶段抑郁症提供可靠的实验依据。