非典型的RNase III蛋白的结构及功能研究

RNA silencing, which is trigged by the introduction of dsRNA molecules, is an important gene regulation mechanism conserved in most eukaryotes. As an effective gene silencing tool, RNAi has been extensivly employed in the studies of functional genomics, drug development and gene threapy. The key step of RNAi is the sequence-specific base pairing between target genes and the small RNA molecules, such as siRNAs and miRNAs. In many eukaryotes, the biogenesis of the small RNA molecules depend on the dsRNA-cleavage activity of Dicer and Drosha, which are members of RNase III family proteins. Noncanonial RNase III proteins were also discoveried in some eukaryotes. Compared to the canonical RNase III family poteins, these noncanonial RNase IIIs are similar to bacterial RNase IIIs in their domain structures assamble, whereas their cleavage products are more similar to Dicer proteins. In this proposal, Entamoeba histolytica RNase III (Eh-RNase III) and Arabidopsis thaliana RNase III (AtRTLs) will be studied in combination of different structural and biochemical techniques, aiming to reveal their important roles in the biogenesis of small RNA molecules and contribute to the therapy of Entamoeba histolytica by providing structural guide to design more specific RNAi methods.

RNA沉默是一种由双链RNA诱导的、在真核生物中高度保守的基因沉默现象。作为一种有效的基因沉默手段，RNAi已经被广泛地应用于功能基因组研究、药物开发和基因治疗等方面。小RNA分子（如siRNA和miRNA）与目的基因的特异性匹配是RNAi途径的核心步骤。在大多数真核生物中，激发RNAi的siRNA和miRNA是由双链RNA在RNase III 家族蛋白Dicer和Drosha的降解下形成的。然而，在一些生物体中却存在一些非典型的RNase III家族蛋白；在结构域的组成上类似细菌RNase III，但形成的产物方面同Dicer更相似。本项目将综合运用结构生物学和生物化学等多种手段对疟疾变形虫中的Eh-RNase III和拟南芥中的RNase III (AtRTL)蛋白进行研究，揭示其在植物和变形虫中小RNA形成方面的作用，为RNAi在疟疾变形虫的控制方面提供结构方面的指导。

RNA沉默是一种由双链RNA诱导的、在真核生物中高度保守的基因沉默现象。作为一种有效的基因沉默手段，基因沉默中的RNA干扰（RNA interference, RNAi）途径已被广泛地应用于功能基因研究、药物开发和基因治疗等方面。在大多数真核生物中，激发RNAi的小非编码RNA（如siRNA和miRNA）是由双链RNA在RNase III 家族蛋白的降解下形成的。在本项目的研究中，我们通过晶体学的方法解析了疟疾变形虫来源的Eh-RNase III蛋白及Eh-RNase III与Mn2+离子复合物的结构，发现Eh-RNase III缺少常规的dsRNA结合结构域，是一种非典型的RNase III家族蛋白。联合体外底物结合和剪切实验，我们发现Eh-RNase III通过多个分子之间的协同作用控制了产物的长度。这部分研究促进了我们对疟疾变形虫体内RNAi机制的了解。除了RNase III、Ago等几个核心蛋白外，RNAi通路还受到其他多个调节蛋白的影响。在本项目的研究中，我们解析了首个C3PO与单链RNA复合物的晶体结构，揭示了C3PO识别和降解底物的分子机制。同闭合的C3PO-ssRNA复合物不同，C3PO单独蛋白采取一种开放的构象，为RNA底物进出结构内部的活性催化区域提供了一个通道。通过定点突变以及体外活性研究，我们的结构同样揭示了C3PO对底物切割位点选择性的基础。这部分研究对了解C3PO蛋白降解siRNA从属链，促进RISC复合体的活化提供了帮助。同RNase III、Ago等蛋白类似，一些DNA分子同样具有RNA降解能力，进而导致目的基因的沉默。8-17和10-23 DNAzyme能够序列特异性地降解目的RNA,是发现最早、研究最广泛的催化DNA分子，但是其催化机制并不明确。在本项目的研究中，我们解析了8-17 DNAzyme与底物类似物的复合物结构，发现8-17 DNAzyme采取一个独特的V-shape构象。我们的结构是首个催化形式的RNA-cleaving DNAzyme结构，显示8-17 DNAzyme应用酸碱催化机制进行底物的降解。除了催化机理外，我们的结构同样为8-17 DNAzyme的优化提供了结构基础。