团头鲂RNase1蛋白的抗菌功能及分子机理研究

Ribonuclease 1 (RNase1) is a vertebrate-specific enzyme that mainly performs digestive activity in herbivorous mammals. Our previous study has shown that RNase1 exhibited both digestive activity and potent antimicrobial activity in an herbivorous fish, blunt snout bream (Megalobrama amblycephala). In order to explore the potential molecular mechanism of its antimicrobial activity, we plan to: 1) study the activity of RNase1 in cell wall structures and interaction with bacterial DNA to explore the antimicrobial mechanisms of RNase1 in vitro; 2) to better understand the regulatory effects of RNase1, its protective effects, immune defense and intestinal microflora will be investigated via an in vivo Aeromonas hydrophila infection model; 3) to further elucidate the potential regulatory mechanisms of RNase1 through the TLR4-MYD88-NF-κB signaling pathway, we will determine the phosphorylation of NF-κb both after over-expression and knockout of RNase1 gene, as well as conduct the test whether knockout of tlr4 and myd88 genes results in diminished protective effects of RNase1. These findings will provide new insights into the molecular mechanism of antimicrobial function of RNase1.

核糖核酸酶1（RNase1）是脊椎动物所特有的一类核酸水解酶，在植食性哺乳动物中主要具有消化功能。我们前期研究发现植食性团头鲂的RNase1重组蛋白不仅具有消化活性而且具有较强的抗菌功能。为了进一步探究其抗菌作用机理，本项目拟从以下几个方面展开研究：1）通过研究RNase1蛋白对细菌细胞膜结构的影响及与细菌细胞质内DNA的相互作用，阐明其体外抗菌作用机理；2）建立团头鲂嗜水气单胞菌感染模型，研究RNase1蛋白对病原菌感染引起机体组织损伤的保护效应、免疫防御及肠道微生物稳态的调控；3）利用LPS诱导细胞损伤模型，探索RNase1过表达和敲除后对NF-κB磷酸化的影响及敲除tlr4和myd88后RNase1蛋白对细胞的保护效应是否受阻，揭示RNase1蛋白的抗菌功能通过TLR4-MYD88-NF-κB信号通路来调控，研究结果可为深入阐明RNase1蛋白的抗菌功能及分子机理提供新思路。

团头鲂（Megalobrama amblycephala）是我国优良的主要淡水养殖鱼类之一，易受各种病原的感染，尤其是嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila），导致了大量的经济损失。核糖核酸酶1（RNase1）是脊椎动物所特有的一类核酸水解酶，在植食性哺乳动物中主要具有消化功能。我们前期研究发现植食性团头鲂的RNase1重组蛋白不仅具有消化活性而且具有较强的抗菌功能。为了进一步探究其抗菌作用机理，本项目主要探究了：（1）团头鲂RNase1蛋白的体外抗菌作用。研究发现RNase1蛋白具有明显的体外抗菌活性，革兰氏阴性和阳性菌分别与RNase1蛋白共孵育后，微摩尔的添加量能杀死嗜水气单胞菌，并呈现出明显的时间和计量效应关系；随着时间的延长，细菌细胞内外膜被破坏，导致内外膜的通透性增加；扫描电镜结果显示革兰氏阴性和阳性菌表面发生皱缩，形态不规则，细胞膜结构不完整。2）建立团头鲂体内嗜水气单胞菌感染模型，研究了RNase1蛋白对病原菌感染引起机体组织损伤的保护效应及免疫防御。结果表明，嗜水气单胞菌感染团头鲂12h后出现明显的眼部及腹腔出血症状，组织学检查发现肠道绒毛增多、肠腔变大、肌层组织变薄，而团头鲂RNase1蛋白预处理能够有效缓解嗜水气单胞菌感染引起的肝脏和肠道组织损伤及细胞凋亡；另外，嗜水气单胞菌感染12h后，RNase1蛋白预处理可诱导NF-κB信号通路中关键基因参与免疫调控；另外，在氧化应激方面，与染菌组相比，RNase1处理组肠道和血液中的六个抗氧化基因表达量显著上调。3）基于宏基因组测序和代谢组研究了RNase1蛋白对嗜水气单胞菌感染引起的团头鲂肠道微生物稳态的调控作用，发现RNase1处理组变形菌门的相对丰度较高，而染菌组厚壁菌门的相对丰度较高。在属水平，RNase1处理组变形杆菌和弧菌的丰富度升高，厚壁菌门、衣原体的丰度下降；代谢组结果表明RNase1蛋白处理组的磷脂、脂肪酸及葡萄糖代谢与对照组和染菌组显著不同。上述研究结果表明RNase1蛋白在抵抗病原体入侵，减少炎症和改善肠道功能方面起着重要作用，可为深入阐明RNase1蛋白的抗菌功能及分子机理提供新思路，同时有助于了解鱼类的天然免疫机制，并可望为在渔业生产中寻找新的抗菌药物提供思路。