油茶ACCase基因的分离克隆及功能研究

油茶是我国重要的油料树种，茶油的品质优良。油茶种子含油率较低，提高油茶种子的含油率是油茶育种的重大目标。植物中的乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl-CoA carboxylase，ACCase）有同质型和异质型，异质型ACCase 由4个亚基组成，是脂肪酸合成的限速酶和关键酶，其中任何一个亚基的超量表达都能提高种子的含油率。本研究旨在利用分子生物学技术从油茶中分离克隆异质型ACCase 4个亚基基因的cDNA序列和基因组序列,研究这4个亚基基因在不同油茶品种、不同组织、不同发育时期的表达差异及其在原核生物中的表达活性；将这4个亚基基因分别转化拟南芥野生型和突变体植株，检验它们的功能及超量表达对提高拟南芥种子含油率的作用，评估这4个基因的超量表达对提高油茶种子含油率的潜力。本项目成果将为油茶的分子育种和培育高含油率种子的油茶新品种奠定物质和技术基础，具有重要的科学意义和应用价值。

ACCase是植物脂肪酸从头合成的关键酶和限速酶，由4个亚基组成，每个亚基的超量表达都可以提高种仁的含油率，克隆该4个亚基的基因并开展相关功能研究是本项目的主要目标。项目组成员采用现代分子生物学技术，从油茶中克隆了编码ACCase 3个亚基accC、accB及accD的全长cDNA以及accA亚基的部分cDNA序列，克隆了accC亚基及accD亚基的基因组序列。采用RT-PCR技术，研究了ACCase 4个亚基基因在‘华硕’等6个油茶品种以及在‘华硕’等6个品种不同组织和种子发育阶段的表达水平，特别是确定了accC及accD亚基基因表达与油脂合成的相关性较大。在基因克隆的基础上，构建了accC亚基的原核表达载体，获得accC的表达蛋白。构建了pJawoh RNAi18-accA/B/C/D RNA干扰载体和超表达载体等，并通过农杆菌介导法转入野生型油菜中，分别获得两代转基因油菜，转基因提高种仁含油率的相关结果有待2014年获得。.除上述原定目标任务外，课题组还扩大了研究范围，开展了与种仁含油率有关其他关键酶基因和其他重要基因的克隆和功能研究。FBA是糖酵解代谢途径中的枢纽调控酶，也是油茶种子油脂合成两种原料即脂肪酸和甘油的枢纽调控酶。本项目分离克隆了FBA基因家族的4个基因。将CoFBA1的全长cDNA序列转化油菜，显示该基因的超量表达可大幅度地提高油菜的生长量和单株产量，转基因提高种仁含油率的相关结果有待2014年获得。DGAT是油脂合成的Kennedy途径中唯一的限速酶，该基因的超量表达也可提高种仁含油率。本项目克隆了CoDGAT1的全长cDNA序列，相关的转基因实验还在进行中。此外，还从油茶中分离克隆了与油脂合成及抗逆等相关等的基因如CoUXS1、CoPht1、CoPht12、CoKASⅡ、CoKASⅢ等。.提高种子含油率是油茶分子育种的重大目标。植物油脂由各种脂肪酸和甘油经脱水形成。本项目旨在克隆与油脂合成相关的关键酶基因，研究相关基因的功能。上述研究为全面揭示油茶种子油脂合成的基本规律提供了宝贵的科学依据，也为提高油茶单位面积产量的分子育种奠定了良好物质基础和技术基础。