螺螨酯抗性桔全爪螨ACCase基因的克隆及功能分析

Panonychus citri is one of the most serious pests in developing resistance to insecticides in China. Spirodiclofen is a tetronic acid acaricide and acts on Accase. The acaricide have become one of the most used acaricides against P. citri because of its long-lasting control and no cross-resistance with other acaricides, but the abuse of the pesticides has led to resistance in some field populations. Now, few researches were done to know about the target insensitivity of spirodiclofen resistance in P. citri. The research wants to clone ACCase gene of the mite and compare the genes of the susceptible and spirodiclofen-resistant strains. The structure and function difference of ACCase gene between the susceptible and resistant strains should be conducted. Molecular detection technology for spirodiclofen-resistance in P. citri should also be developed. The research would be useful for early detection and management of spirodiclofen resistance.

桔全爪螨 Panonychus citri 是我国抗性最严重的农业害虫之一，螺螨酯为第一个特窗酸类杀螨剂，作用靶标为乙酰辅酶A羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACCase)），由于持效期长，与其它类型杀螨剂没有交互抗性，成为防治桔全抓螨的当家产品。然而由于过分使用，一些田间种群已经对其产生了抗性。目前国内外对螺螨酯抗性靶标不敏感性研究很少，本研究拟以室内选育的桔全爪螨抗性品系和敏感品系为材料，利用分子克隆与基因表达技术，通过比较分析桔全爪螨抗性和敏感品系ACCase基因结构和表达，明确ACCase基因变异对桔全爪螨抗螺螨酯的作用；发展螺螨酯抗性的分子检测技术。该项目的实施对螺螨酯抗性的早期检测与治理具有重要意义。

与敏感种群相比，桔全爪螨抗螺螨酯种群幼螨、第一若螨及第二若螨对螺螨酯的敏感性分别降低103、157与51.2倍，而卵的敏感性仅降低4.6倍。克隆获得了桔全爪螨ACCase基因，该基因全长7627bp，编码2423个氨基酸。桔全爪螨ACCase碱基与二斑叶螨的同源率达82%，与温室白粉虱的同源率为61%。桔全爪螨ACCase氨基酸序列与二斑叶螨的同源率高达90%，与温室白粉虱的同源性为60%。采集了重庆、海南、广西、江西、广东与福建等5个田间种群，广西、湖南、江西种群对螺螨酯抗性倍数分别达28、22、33倍，为中等抗性；而福建及广东种群抗性倍数分别达71及66倍，为高等抗性。田间种群中，除了广东种群对螺甲螨酯抗性倍数达36.9倍，为中等抗性外，其它田间种群对螺甲螨酯均没有产生抗性。所有种群均对螺虫乙酯敏感。.克隆比较了桔全爪螨敏感种群与抗螺螨酯种群的乙酰辅酶A羧化酶的核苷酸序列，比对结果表明1525位点a-t,7058位点a-g,7223位点t-a，导致36位点赖氨酸 Lys(K)突变为精氨酸 Arg(R)，95位点脯氨酸 Pro(P)突变为丝氨酸 Ger (S)，316位谷氨酸 Glu (E)突变为天冬氨酸 Asp(D)。突变为点位于乙酰辅酶A羧化酶中心区域，36与95突变位点位于CPSase_L_chain（氨甲酰磷酸合成酶，N端区域）功能域；而316突变位点位于ATP-grasp_4超家族（ATP-dependent carboxylate-amine ligase activity）功能域。.抗性检测突变引物，7223突变为点引物（Sense 1TGAACAGCAAATCAAGGG；antis1：AAGGGAAGATGGATCATCGATTTGC，antir1：TAGGGAAGATGGATCATCGATTTGC，目标产物440bp）；7508突变为点引物（正向：Sense2 CTTTAAATTTCTTCAACAG；antis2：TTTTAAATTTCTTCAACAG，antir2：ATAGTAGGGTGGTGTTA，目标产物350bp）；1525突变为点引物（Sense3 GGTGCCTACTCTTTCCTG；antis3：TGTTCCTGCCGACTCATA，antir3：AGTTCCTGCCGACTCATA，目标产物496bp）。对抗螺螨酯桔全爪螨种群的D